突破不可成藥靶點(diǎn)的PROTAC技術(shù)解讀

       PROTAC(Proteolysis Targeting Chimera)蛋白靶向降解嵌合體，是通過泛素蛋白酶體系統(tǒng)誘導(dǎo)靶向蛋白降解的一種全新技術(shù)。用來清除腫瘤細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白，使其不能發(fā)揮致癌作用，以達(dá)到腫瘤治療的目的。癌癥從本質(zhì)上來說是一種基因病，幾乎所有的癌癥都源于基因突變，除了手術(shù)切除、放療和化療外，分子靶向技術(shù)也在迅速發(fā)展?；蛲蛔兯a(chǎn)生的致癌因子，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)起著十分關(guān)鍵的作用。而PROTAC分子可以直接將致癌因子清除，從而靶向治療腫瘤。PROTAC分子由三種元素組成，E3泛素連接酶配體、靶蛋白配體和連接子Linker。E3泛素連接酶配體負(fù)責(zé)特異性招募E3泛素連接酶。靶蛋白配體用于靶向和捕獲目標(biāo)蛋白。Linker用于結(jié)合這兩個(gè)配體形成穩(wěn)定的三元復(fù)合物。因此PROTAC分子能夠?qū)3泛素連接酶募集到靶點(diǎn)蛋白附近，為靶點(diǎn)蛋白貼上"泛素"標(biāo)簽，而在細(xì)胞上打上泛素標(biāo)簽的蛋白將被送入蛋白酶體進(jìn)行降解。這樣PROTAC分子就能夠特異性的促進(jìn)致病蛋白的降解。

       對(duì)于PROTACR的研究是從2001時(shí)開始有逐漸的報(bào)道，在2017年之后出現(xiàn)了研究的井噴狀態(tài)。

       傳統(tǒng)小分子藥物研發(fā)面臨的困境和挑戰(zhàn)

       根據(jù)Global Data報(bào)告Look Ahead to 2022 -The Future of Pharma，預(yù)計(jì)未來5年生物制劑的銷售額將大大超過創(chuàng)新小分子藥物的銷售額。預(yù)計(jì)到2027年，生物制劑的銷售額將比小分子銷售額高出1200億美元。

       相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道與疾病相關(guān)靶點(diǎn)蛋白有62%是不可成藥的，還有25%約有1200多種不是適合作為藥物靶點(diǎn)的。已經(jīng)有藥物上市的靶點(diǎn)占據(jù)13%。所以市面上能夠上市銷售的成藥靶點(diǎn)藥物占比是很低的，很多跟疾病相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白是不可成藥的。所以綜上所述，小分子藥物的市場(chǎng)份額逐漸減少，也是由于小分子藥物的研發(fā)起步早，相對(duì)簡(jiǎn)單，比較早的被發(fā)現(xiàn)，但成藥靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)緩慢，小分子藥物發(fā)現(xiàn)增速降低了。大量難成藥的靶點(diǎn)沒有合適的藥物去治療。而且化藥在治療過程面臨著靶點(diǎn)的基因突變盡而帶來耐藥性。小分子降解劑的發(fā)展，尤其是蛋白降解靶向嵌合體（PROTACs），使得靶向不可成藥的蛋白靶點(diǎn)或耐藥突變靶點(diǎn)成為可能。

       PROTAC成藥特點(diǎn)，突破不可成藥靶點(diǎn)及耐藥

       細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的兩大系統(tǒng)，在真核細(xì)胞中負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解的兩大系統(tǒng)分別是泛素蛋白酶體系統(tǒng)和自噬溶酶體系統(tǒng)。泛素蛋白酶體系統(tǒng)將體內(nèi)錯(cuò)誤折疊的可溶性蛋白，它被泛素E3連接酶貼上了泛素（Ub）的標(biāo)簽，被貼上泛素標(biāo)簽的蛋白可以直接結(jié)合蛋白酶體的泛系受體而被降解，也可以結(jié)合到運(yùn)輸載體上通過載體的PBD端與蛋白酶結(jié)合，進(jìn)而被降解。

       PROTAC無需與靶蛋白高強(qiáng)度結(jié)合，可靶向蛋白范圍擴(kuò)大，它與小分子藥物作用機(jī)制的區(qū)別是，它是"事件驅(qū)動(dòng)"，觸發(fā)靶蛋白與E3連接酶的結(jié)合，無需直接抑制靶蛋白的功能活性，只要能給靶蛋白貼上泛素標(biāo)簽基本上就算是成功了，也無需跟靶蛋白長(zhǎng)時(shí)間和高強(qiáng)度的結(jié)合。

       PROTAC它是促使靶蛋白降解之后可以從復(fù)合物中解離進(jìn)入下一個(gè)催化循環(huán)，因此根據(jù)這一特點(diǎn)有可能將來用藥的頻率和劑量都相對(duì)于小分子藥小很多。PROTAC跟蛋白的結(jié)合不需要很高的結(jié)合活性，因?yàn)橛写呋男再|(zhì)，就可以用低劑量很長(zhǎng)的周期給藥的特點(diǎn)。

       而小分子是一定要"占位驅(qū)動(dòng)"的形式，一定要連接到靶蛋白的某一結(jié)構(gòu)域上形成一個(gè)穩(wěn)定的連接，從這種關(guān)系上來說，小分子化藥一定要有很強(qiáng)的活性，才可進(jìn)入藥物的開發(fā)過程。小分子藥物是需要足夠多的劑量使靶點(diǎn)飽和，并且需要足夠長(zhǎng)的半衰期能夠長(zhǎng)久持續(xù)抑制靶蛋白。

       PROTAC克服靶點(diǎn)耐藥潛力明確

       化藥在治療腫瘤時(shí)后期會(huì)由于腫瘤基因突變導(dǎo)致化藥的耐受，理論上PROTAC分子是可以避免這樣的情況發(fā)生的。

       PROTAC選擇性不同于TKI（洛氨酸激酶抑制劑），PROTAC分子除了發(fā)揮與靶蛋白結(jié)合之外，還需要使靶蛋白與E3連接酶保持穩(wěn)定的空間構(gòu)象才能完成泛素化反應(yīng)。這相當(dāng)于對(duì)蛋白選擇性的篩選。例如多激酶抑制劑Foretinib在竟?fàn)幮越Y(jié)合實(shí)驗(yàn)中對(duì)100余種激酶具有較強(qiáng)的抑制活性（選擇性差），而基于Froetinib設(shè)計(jì)的PROTAC分子可以結(jié)合54種激酶（選擇性有所提高），但最終只能降解＜15種激酶（選擇性大幅提高），PROTAC在某些靶點(diǎn)上有潛力實(shí)現(xiàn)更高的選擇性，從而避免"off target"帶來的正毒副作用。

       PROTAC引發(fā)蛋白降解后即從復(fù)合物中分離，并進(jìn)入下一個(gè)催化循環(huán)，藥物作用效率高，可快速將細(xì)胞內(nèi)靶蛋白降解，并且細(xì)胞內(nèi)疾病蛋白合成速度較為緩慢，即便經(jīng)過代謝后PROTAC在體內(nèi)清除細(xì)胞仍需要較長(zhǎng)的時(shí)間將靶蛋白恢復(fù)至發(fā)揮生理作用的水平，從而有望延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，因此PROTAC有望在低藥物劑量低給藥頻率下實(shí)現(xiàn)持久的療效，這一潛力在臨床前研究中已得到初步證實(shí)，一款靶向RIPK2的PROTAC降解劑動(dòng)物給藥168h后，體內(nèi)血藥濃度已降到10ng/ml以下，而此時(shí)RIPK2蛋白仍然可以維持較低含量，致炎因子TNFα也維持在較高的抑制水平。

       機(jī)遇和挑戰(zhàn)

       Linker的設(shè)計(jì)合成需要復(fù)雜的優(yōu)化過程，目前報(bào)道的PROTAC分子中，Linker的選擇以聚乙二醇和烷基鏈為主，但線性脂肪鏈或醚結(jié)構(gòu)有被氧化代謝的風(fēng)險(xiǎn)，大大減少了藥物暴露濃度和時(shí)間，加快PROTAC分子排出體外，其它的Linker還有烷烴、三唑、哌嗪、哌啶等，Linker的設(shè)計(jì)與選擇對(duì)于PROTAC分子的成藥性非常重要，以ARV-771為例，其采用醇類作為L(zhǎng)inker時(shí)對(duì)BRD4蛋白展現(xiàn)出較好的降解能力，但當(dāng)把Linker換成長(zhǎng)度相當(dāng)?shù)暮蟹枷悱h(huán)的結(jié)構(gòu)時(shí)，盡管靶蛋白和E3連接酶配體沒有改變，但其不再對(duì)BRD4展現(xiàn)出降解能力。

       當(dāng)前研究的PROTAC分子集中于靶向BET、AR、BTK等成熟靶點(diǎn)，仍有大量病理機(jī)制明確的蛋白未被探索，泛素-蛋白酶體降解途徑發(fā)生于細(xì)胞內(nèi)，膜表面蛋白（約占編碼蛋白的20%）的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域很難找到合適的口袋供小分子配體結(jié)合，PROTAC分子在膜蛋白降解領(lǐng)域尚未取得技術(shù)突破，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)的靶點(diǎn)例如核內(nèi)蛋白、細(xì)胞器蛋白等也是PROTAC技術(shù)的潛力發(fā)揮作用的領(lǐng)域。許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）靶點(diǎn)被認(rèn)為是"Undruggable"，且血腦屏障的存在使治療藥物難以達(dá)到病灶，阿爾茲海默癥等神經(jīng)退行性疾病以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥尚無有效治療藥物，存在大量未滿足臨床需求、蛋白降解劑有望通過降解中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致病蛋白如Tau/Alpha-synuclein/Huntingtin等帶來差異化的治療效果，有潛力克服現(xiàn)有療法的局限性。包括小核酸藥物、抗體等。

       高通量評(píng)價(jià)PROTAC活性手段有限

       由于PROTAC分子在體內(nèi)能以亞化學(xué)劑量發(fā)揮催化循環(huán)作用，因此傳統(tǒng)的藥化動(dòng)力學(xué)（PK）、藥效動(dòng)力學(xué)（PD）方法不能很好的評(píng)估PROTAC的PK和PD性質(zhì)，針對(duì)PROTAC分子目前尚于成熟的PK/PD評(píng)價(jià)體系，量效關(guān)系、時(shí)效關(guān)系的規(guī)律尚未完全掌握，蛋白降解所致的毒 性尚未透徹了解，在驗(yàn)證靶標(biāo)蛋白是否被成功降解上，傳統(tǒng)方法如免疫印跡、ELISA以及質(zhì)譜存在耗時(shí)、價(jià)格昂貴、通量低的缺點(diǎn)，熒光信號(hào)是具有潛力的可行替代方法。高通量評(píng)價(jià)PROTAC活性的檢測(cè)方法亟待開發(fā)。

       分子膠（Molecular Glue Degraders）

       分子膠降解劑（Molecular Glue Degraders,MGDs）是另一類可以誘導(dǎo)泛素E3連接酶復(fù)合體/底物受體與靶蛋白相互作用的小分子。MGD可以拉近致病蛋白與E3連接酶的空間距離，增強(qiáng)原本具有的PPI或促進(jìn)形成新的PPI。從而使得被泛素化的致病蛋白被蛋白酶所降解，免疫調(diào)節(jié)劑（IMiDs）沙利度胺、來那度胺、泊馬度胺等是典型的分子膠，其發(fā)揮治療腫瘤作用機(jī)制之一就是通過分子膠水的作用介導(dǎo)IKZF1/3(淋巴細(xì)胞增殖關(guān)鍵國轉(zhuǎn)錄因子)降解。

       PROTAC與MGD均通過泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)靶蛋白降解，但二者分子設(shè)計(jì)及作用機(jī)制存在顯著不同。PROTAC分子是由靶蛋白配體、Linker、E3連接酶彈頭共價(jià)結(jié)合形成的異雙功能三無復(fù)合物，其分子量較大，打破了藥物設(shè)計(jì)的5類原則。MGD是單價(jià)小分子，分子量較小，符合5類原則。PROTAC分子直接與靶蛋白結(jié)合因此需要結(jié)合口袋，MGD通過與E3連接酶結(jié)合形成的位點(diǎn)與靶蛋白相互作用，自身無需具備直接與靶蛋白結(jié)合的口袋。相較于PROTAC分子，MGD具有較高的細(xì)胞通透性和更好的口服吸收。目前較為成熟的蛋白降解技術(shù)，PROTAC與分子膠均依賴于蛋白酶體系統(tǒng)，而基于自噬/內(nèi)體-溶酶體系統(tǒng)（機(jī)體另一重要的蛋白降解系統(tǒng)）去開發(fā)新型蛋白降解劑同樣成為研究熱點(diǎn)。基于溶酶體的蛋白降解技術(shù)主要包括，溶酶體靶向嵌合體（LYTAC）、自噬體靶向嵌合（AUTAC）、自噬小體偶聯(lián)技術(shù)（ATTEC）等，該類技術(shù)有望與現(xiàn)在蛋白降解劑形成互補(bǔ)，拓展可降解靶點(diǎn)范圍。