PROTAC技術后，DUBTAC揭示新型靶向治療的未來

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作者：balabala 來源：藥渡網(wǎng)

2024-07-10

靶向嵌合體蛋白水解（PROTAC）技術代表了藥物發(fā)現(xiàn)領域的突破性發(fā)展，利用泛素蛋白酶體系統(tǒng)特異性降解與疾病相關的蛋白質，多項目已進入臨床開發(fā)。但針對CF和某些癌癥，需開發(fā)靶向蛋白穩(wěn)定劑TPS以對抗異常蛋白降解。

靶向蛋白質穩(wěn)定技術（targeted protein stabilization，TPS）是近年來生物醫(yī)學領域一種新興的技術，旨在通過特定的方法來穩(wěn)定細胞內的蛋白質，從而影響其功能和行為。這種技術潛在應用廣泛，從基礎研究到新藥開發(fā)都有重要價值。

去泛素化酶靶向嵌合體（deubiquitinase-targeting chimeras，DUBTACs）是近年來逐漸發(fā)展的一種靶向蛋白質穩(wěn)定技術，DUBTACs一般由靶蛋白配體、去泛素化酶配體和Linker三部分組成，這樣的結構設計使得DUBTAC分子可以同時結合靶蛋白和去泛素化酶，誘導靶蛋白和去泛素化酶靠近，去除靶蛋白上的泛素鏈，從而達到穩(wěn)定以泛素化依賴方式降解的特定蛋白質的水平（圖1）。

圖1. DUBTAC平臺

在這里，我們總結了近年來DUBTAC技術的研發(fā)進展，詳細探討了其在生物醫(yī)藥領域的應用前景和潛在挑戰(zhàn)。

基于OUTB1的DUBTACs

在2022年初，加州大學伯克利分校的Daniel K. Nomura教授團隊運用基于活性的蛋白質圖譜分析（activity-based protein profiling, ABPP）對65種去泛素化酶的反應性半胱氨酸進行全局性分析。

研究結果發(fā)現(xiàn)，泛素化酶OTUB1的C23位點不參與酶活性的調控且具有較高的親核性，是一個理想的配體結合位點。由于細胞中主要介導蛋白質降解的最豐富的泛素鏈是K48鏈，而OTUB1則是靶向移除K48鏈的去泛素化酶。

理論上，利用OTUB1去針對性地去除特定蛋白上的泛素鏈，防止以泛素化依賴方式被降解的特定蛋白質被蛋白酶體降解，是非常有效的。

圖2. EN523結構

（1）ΔF508-CFTR-DUBTACs

Daniel K. Nomura教授團隊基于上述發(fā)現(xiàn)篩選出了一個與OUTB1高親和力結合的共價配體EN523（圖2）。其中，EN523與OTUB1結合是通過EN523的丙烯酰胺部分與OTUB1變構半胱氨酸殘基Cys23共價作用來實現(xiàn)的。他們通過體外實驗證明EN523對OTUB1的酶活性沒有顯著影響。

隨后，研究人員將篩選到的EN523與ΔF508-CFTR調節(jié)劑Lumacaftor連接起來所獲得的異源雙功能小分子NJH-2-057用于靶向CFTR突變體ΔF508-CFTR的穩(wěn)定從而改善囊性纖維化。

實驗結果表明，NJH-2-057可以有效穩(wěn)定ΔF508-CFTR，而單獨使用Lumacaftor的結果則與對照組差異不明顯（圖3）。這一結果為DUBTAC技術的發(fā)展提供了概念驗證。

圖3. NJH-2-057穩(wěn)定CFTR

（2）WEE1-DUBTACs

Daniel K. Nomura教授團隊隨后將DUBTAC技術應用于提高抑癌基因WEE1的穩(wěn)定性，WEE1是一種非惡性真核體細胞中的腫瘤抑制激酶，可磷酸化細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK1）-細胞周期蛋白B1復合物，以抑制有絲分裂S期和G2期的細胞周期進展，并且必須下調其活性才能發(fā)生有絲分裂進展。WEE1在許多腫瘤中被降解以促進癌細胞增殖。穩(wěn)定癌細胞中WEE1激酶的水平有望阻止腫瘤生長。

研究人員將EN523與一種臨床WEE1抑制劑AZD1775通過烷基鏈linker或基于聚乙二醇的linker連接合成了靶向腫瘤抑制性激酶WEE1的DUBTAC。研究顯示，DUBTAC能顯著穩(wěn)定肝癌細胞系中的WEE1，而EN523或AZD1775單獨治療對WEE1水平沒有影響（圖4）。

圖4. WEE1 DUBTAC穩(wěn)定WEE1

這進一步證明了DUBTAC技術用于TPS的普適性，此外，Daniel K. Nomura教授團隊的研究也強調了使用化學蛋白質組學支持的共價配體發(fā)現(xiàn)平臺的實用性。

（3）TF-DUBTACs

2022年6月份，來自美國哈佛醫(yī)學院的Wenyi Wei教授團隊在此前研究的基礎上，使用EN523招募去泛化素酶OTUB1進一步開發(fā)了能夠穩(wěn)定抑癌轉錄因子（Transcription Factor，TF）的首個TF-DUBTAC藥物平臺，旨在通過穩(wěn)定TF實現(xiàn)對腫瘤的治療（圖5）。

圖5. TF-DUBTAC平臺示意圖

研究人員分別將FOXO3A、p53、IRF3三種轉錄因子的結合配體疊氮基修飾DNA寡核苷酸與BCN（bicyclononyne）修飾的去泛素化酶OUTB1的共價配體（DUBL-X-BCN 1-10）通過SPAAC反應連接起來，設計合成出了一系列靶向FOXO3A、p53、IRF3三種轉錄因子的DUBTAC分子（圖6），緊接著，研究人員通過體外實驗測定了細胞水平上化合物對靶蛋白的穩(wěn)定作用，并篩選出有效的TF-TUBTAC分子，細胞水平活性測試研究表明，相應的TF-DUBTAC 以OUTB1依賴的方式分別穩(wěn)定了細胞內的FOXO3A、p53、IRF3。

圖6. TF-DUBTAC作用機理圖示

這進一步說明了TF-DUBTAC是一個可推廣的平臺，可實現(xiàn)抑癌轉錄因子的選擇穩(wěn)定性，可作為抑制腫瘤生成的治療手段。同時也表明DUBTAC技術在癌癥治療方面的普適性和有效性。

基于USP7的DUBTACs

由于基于去泛素化酶OTUB1共價配體開發(fā)出的DUBTACs可能與其他共價抑制劑類似存在毒性或超敏反應等劣勢，因此，開發(fā)基于其他去泛素酶的可逆招募配體是TPS領域的重要發(fā)展方向。

2024年4月份，美國哈佛醫(yī)學院的Wenyi Wei教授團隊開發(fā)了第一個基于去泛素化酶USP7的DUBTAC，其利用USP7的非共價配體實現(xiàn)了選擇性穩(wěn)定CFTR和AMPK蛋白的目的（圖7）。

圖7.USP7-DUBTAC平臺示意圖

（1）ΔF508-CFTR-DUBTACs

首先，研究人員選擇先前報道過的USP7 ligand #1作為去泛素化酶USP7的配體，通過分析配體與USP7復合物的共晶結構，選擇配體分子USP7i-#4a結構中位于結合口袋外的氨基作為linker連接位點進行分子設計。

研究人員將USP7 ligand#1與ΔF508-CFTR調節(jié)劑Lumacaftor通過linker連接合成了一系列的靶向CFTR的DUBTAC的分子，并在細胞水平上測定化合物對CFTR蛋白的穩(wěn)定作用（圖8）。

圖8.基于usp7的dubtac來穩(wěn)定靶蛋白

研究結果表明，化合物MS6869以相對特定的方式促進了CFTR的穩(wěn)定，其有效性與先前報道的基于OTUB1的CFTR-DUBTAC相當。

（2）AMPK-DUBTACs

隨后，研究人員基于兩種不同的USP7配體設計并合成了一系列的靶向AMPK的DUBTAC分子（圖8），并對這些化合物進行AMPK蛋白穩(wěn)定作用測試，研究表明，不同的USP7配體衍生的AMPK-DUBTAC可以選擇性地穩(wěn)定AMPK β的不同亞型，導致AMPK信號轉導升高。

這些結果無一不說明了基于USP7的DUBTAC技術開發(fā)的可行性。

展望

DUBTAC技術的出現(xiàn)，使得許多領域有望從主動泛素化和降解蛋白的靶向去泛素化中獲益。例如穩(wěn)定線粒體中的BAX水平以誘導細胞凋亡，穩(wěn)定STING用于免疫腫瘤學應用或在胰腺細胞中穩(wěn)定葡萄糖激酶用于成年發(fā)病型糖尿病2型。其他受益于DUBTAC的靶標包括各種為了維持癌細胞增殖而被主動泛素化和降解的腫瘤抑制因子。

除了囊性纖維化之外，還有許多其他遺傳疾病也可以通過dubtac穩(wěn)定獲益。包括高雪氏病或帕金森病中的葡萄糖腦苷脂酶突變和苯丙酮尿癥中的苯丙氨酸羥化酶和富馬酰乙酰乙酸羥化酶突變等。

我們總結了近年來DUBTAC技術的研究進展，展現(xiàn)了DUBTAC技術在提高蛋白質穩(wěn)定效率方面的顯著優(yōu)勢，我們也對DUBTAC技術的發(fā)展前景做出了展望，期待更多研究者能夠加入這一創(chuàng)新領域，共同推動生物醫(yī)藥技術的發(fā)展。

編者按：

DUBTAC通過穩(wěn)定關鍵蛋白質來對抗疾病，如CFTR和WEE1，已在實驗室研究中取得初步成功。隨著技術的不斷進步，基于USP7等其他去泛素酶的DUBTAC也在開發(fā)中，有望克服現(xiàn)有技術的局限性。展望未來，DUBTAC技術有望在更多領域發(fā)揮作用，為治療各種疾病提供新的策略。

參考文獻

[1]Deubiquitinase-targeting chimeras for targeted protein stabilization

[2]TF-DUBTACs Stabilize Tumor Suppressor Transcription Factors

[3]USP7-Based Deubiquitinase-Targeting Chimeras Stabilize AMPK

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