抗體技術的研發(fā)現狀與進展（上篇）

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作者：小米蟲來源：CPhI制藥在線

2022-01-05

隨著抗體藥物的需求不斷加大，抗體技術的發(fā)展也日新月異，從多克隆抗體制備到單克隆抗體篩選，取得了鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體到全人源抗體等一系列突破性的成果，抗體技術成為生物技術領域特別是生物醫(yī)藥領域研究的熱點。

抗體技術的研發(fā)現狀與進展

抗體類生物治療藥物因其具有靶向性強、特異性好、治療效果顯著等優(yōu)點，在生物藥中占據越來越重要的地位。近年來，抗體藥物獲批數量顯著增加，市場占有率節(jié)節(jié)攀升，成為生物藥中增長最快的領域。隨著抗體藥物的需求不斷加大，抗體技術的發(fā)展也日新月異，從多克隆抗體制備到單克隆抗體篩選，取得了鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體到全人源抗體等一系列突破性的成果，抗體技術成為生物技術領域特別是生物醫(yī)藥領域研究的熱點。

根據發(fā)展歷程，抗體技術可分為多克隆抗體技術、雜交瘤單克隆抗體技術和基因工程抗體技術3個階段。多克隆抗體的制備多通過免疫動物獲得，當抗原注射到動物體內后就會產生針對該抗原的抗體。大多數抗原表面成分復雜，具有多種不同的抗原表位，因而免疫血清中產生的抗體為針對多種抗原成分或抗原表位的、綜合的、不均一的多克隆抗體。目前，恢復期患者血漿療法用于急性病**傳染病的應急治療仍受到廣泛關注，如在流感、埃博拉、嚴重急性呼吸綜合征（SARS）及新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）流行期間均使用患者恢復期血漿療法進行治療或臨床研究。雜交瘤單克隆抗體技術是將能夠產生抗體的B淋巴細胞和能夠無限繁殖的腫瘤細胞融合，融合后的子代細胞既可產生抗體，又能夠無限傳代，從而獲得抗體純度高、理化性質均一、特異性強的單克隆抗體?；蚬こ炭贵w技術是利用重組DNA和蛋白質工程技術等對編碼抗體的基因按不同需要進行加工改造和重新裝配，經轉染適當的受體細胞所表達的抗體分子。利用基因工程抗體技術減少抗體鼠源成分，增加人源化程度，降低免疫原性，成為第三代抗體技術。目前常見的技術包括鼠源抗體人源化技術，以及抗體文庫展示技術、轉基因小鼠技術和單細胞測序技術等人源抗體篩選技術。

隨著現代生物技術的不斷發(fā)展，結合抗體藥物的生物學特性，研發(fā)人員在傳統(tǒng)抗體技術的基礎上不斷優(yōu)化創(chuàng)新，力求通過更簡便快速的方法，獲得免疫原性更低、人體相容性更好及成本更低的治療性抗體。

1、雜交瘤單克隆抗體技術

雜交瘤單克隆抗體技術是將免疫動物的 B 淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，形成在體外長期存活并能分泌免疫球蛋白的雜交瘤細胞，通過克隆化得到來自單個雜交瘤細胞的雜交瘤單克隆細胞系，生產大量單克隆抗體。此過程中，雜交瘤細胞 2 次篩選至關重要。最傳統(tǒng)的二次雜交瘤篩選方法為有限稀釋法。該方法操作簡單，不需要特殊設備，但人工操作速度慢、效率低、耗時長、易出錯，不能滿足高通量篩選的要求。流式分選技術也較多用于雜交瘤細胞的篩選，該方法具有自動化速度快和精確度較高等優(yōu)點，但需要對細胞進行熒光標記，且檢測結果易受細胞周期影響。全自動細胞篩選系統(tǒng)（Cellcelector）是一種當前廣泛應用的雜交瘤篩選技術，該技術具有高通量，自動化，高效率，可編程、量化和存檔及追溯等優(yōu)點，可縮短研發(fā)周期，降低成本。

雜交瘤單克隆抗體技術方便、簡單、成本低，但僅能用于鼠源抗體篩選。1986年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準上市的第一個用雜交瘤技術篩選的鼠源抗體藥物莫羅單抗（muromomab-CD3）。鼠源抗體能夠被人體免疫系統(tǒng)識別，引起強烈的人抗鼠抗體反應，使得藥物療效減弱，并引起嚴重的不良反應。為解決這一問題，科學家利用基因工程方法對鼠源抗體進行人源化，在一定程度上減弱了人抗鼠抗體反應。直至 1994 年，美國FDA 才批準了第二個抗體藥物即人鼠嵌合抗體藥物阿昔單抗（abciximab）上市。此后，通過雜交瘤技術篩選得到抗體通常需要進一步進行人源化改造，才能作為抗體藥物進入臨床應用。

2、抗體文庫展示技術

抗體文庫展示技術是近 30 多年快速發(fā)展起來的一項技術，主要用來篩選人源抗體。利用聚合酶鏈反應（PCR）從 B 細胞中擴增出抗體的重鏈和輕鏈群，將它們連入合適的載體表達隨機的聯(lián)合抗體文庫。按抗體基因來源，目前抗體庫主要有天然抗體庫、半合成抗體庫、全合成抗體庫和混合抗體庫等類型。同時，隨著計算機輔助分析和虛擬設計的發(fā)展，還發(fā)展出表位特異性的靶向抗體庫技術平臺。根據抗體文庫所用載體的不同，目前主要的技術有噬菌體展示技術、酵母表面展示技術、核糖體展示技術和mRNA展示技術等。

噬菌體展示技術的基礎為噬菌體侵蝕細菌并利用細菌表達自身外殼蛋白等過程。2002 年，美國 FDA 批準上市的首個全人源抗體藥物阿達木單抗（adalimumab）就是利用噬菌體展示文庫篩選得到的。此外，具有結構簡單、相對分子質量小、穩(wěn)定性強、易于重組改造、組織穿透力強等優(yōu)點的納米抗體，也通常是利用免疫羊駝聯(lián)合噬菌體展示文庫技術篩選而來，如2018年9月美國 FDA 批準上市的納米抗體藥物-卡普賽珠單抗（caplacizumab）。

酵母細胞表面展示技術是一項真核蛋白展示技術。作為真核表達系統(tǒng)，酵母細胞表面展示技術可以對蛋白進行翻譯后修飾，且真核分泌系統(tǒng)有"質量"控制機制，能阻止錯誤折疊的蛋白被輸運出內質網。此外，可使用流式細胞術對已構建的酵母細胞庫進行定量和實時篩選，高效便捷。2020年，美國FDA批準在巴斯德畢赤酵母細胞表達得到的抗體藥物依普奈珠單抗（eptinezumab）上市，使其成為首個酵母表達的抗體藥物。目前該技術也被用于納米抗體的開發(fā)。

核糖體展示技術和mRNA展示技術作為新興的克隆展示技術，完全在體外進行。通過構建 DNA 文庫，在體外進行轉錄與翻譯，最終形成"mRNA-核糖體-蛋白質"（核糖體展示技術）或"cDNAmRNA-蛋白質"（mRNA 展示技術）三聚體，使目的蛋白的基因型（mRNA）和表型（蛋白質）聯(lián)系起來，最后從中分離 mRNA 或 cDNA 進行逆轉錄 PCR（RT-PCR）擴增。該類技術與噬菌體或酵母細胞展示技術相比，具有建庫簡單、庫容量大、分子多樣性強、篩選方法簡便、可通過引入突變和重組技術提高靶標蛋白親和力等優(yōu)點。同時，mRNA展示技術經逆轉錄形成的 cDNA/mRNA 雜交雙鏈，還避免了RNA 二級結構和三級結構對體外篩選的干擾。目前，越來越多的研究人員將該類技術應用于新藥開發(fā)領域。

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參考資料

[1]武瑞君,桑曉冬,李治非,敖翼,范玲.抗體技術的研發(fā)現狀與展望[J].中國藥理學與毒理學雜志,2021,35(05):374-381.

[2]馮健男,喬春霞.人源治療性抗體研發(fā)技術進展[J].南京醫(yī)科大學學報(自然科學版),2020,40(11):1571-1574.

作者簡介：小米蟲，藥品質量研究工作者，長期致力于藥品質量研究及藥品分析方法驗證工作，現就職于國內某大型藥物研發(fā)公司，從事藥品檢驗分析及分析方法驗證。