抗血小板活性肽藥物的研究進(jìn)展

       血小板活化、聚集是誘導(dǎo)血管內(nèi)血栓形成的重要因素，抗血小板治療在心腦血管疾病的防治中至關(guān)重要。目前臨床常用的抗血小板藥物主要有：①阿司匹林，主要通過不可逆地阻斷 COX-1 合成，導(dǎo)致 TXA2 合成減少，從而抑制血小板活化、聚集。②氯吡格雷，主要通過不可逆抑制ADP 與其受體P2Y12 結(jié)合，抑制 ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集。③替格瑞洛，主要通過可逆地與 ADP-P2Y12 受體相互作用，抑制 ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。④小分子PAR-1拮抗劑，目前已報道的PAR-1小分子拮抗劑包括vorapaxar、atopaxar等。vorapaxar在2014年5月被FDA批準(zhǔn)上市，主要用于有心臟病發(fā)作史患者以及動脈栓塞患者，以降低心臟病進(jìn)一步發(fā)作、中風(fēng)等死亡危險；atopaxar的臨床研究主要針對患有急性冠狀動脈綜合癥(acute coronary syndrome，ACS) 或高危冠狀動脈疾病(coronary artery disease, CAD) 的患者，但遺憾的是其II期臨床試驗已宣告終止。⑤阿昔單抗、替羅非班、依替巴肽均屬于GPⅡb /Ⅲa 受體拮抗劑，雖三者共享同一靶受體，但在結(jié)構(gòu)上三者有所不同，阿昔單抗為抗β3 單克隆抗體，替羅非班和依替巴肽是模擬與纖維蛋白原結(jié)合的序列，其中，替羅非班為左旋酪氨酸非肽類結(jié)構(gòu)，而依替巴肽是 7 個氨基酸組成的活性肽。

       研究證實(shí)，RGDS 序列是纖維蛋白原結(jié)合細(xì)胞的活性位點(diǎn)，能夠抑制血小板凝集和纖連蛋白結(jié)合到活化的血小板上，從而抑制血栓形成。此后，從各種天然產(chǎn)物中分離的抗血小板肽相繼出現(xiàn)。這些天然抗血小板肽的抗血小板聚集效果雖然沒有臨床藥物好，但其副作用小，因而備受關(guān)注。此外，在天然抗血小板肽基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和人工合成開發(fā)抗血小板肽具有潛在的生物學(xué)價值和醫(yī)學(xué)價值。

       按來源不同，可將抗血小板肽分為動物源抗血小板肽、植物源抗血小板肽、微生物源抗血小板肽和人工合成抗血小板多肽。

       1、動物源抗血小板肽

       1990年，有學(xué)者基于先前研究關(guān)于血液凝固和牛奶凝固兩個重要生理過程的相似性，從乳蛋白中發(fā)現(xiàn)了一種與人纖維蛋白原中RGDS 結(jié)構(gòu)和功能極其相似的多肽，此多肽可從人乳鐵蛋白中分離純化，其氨基酸序列為 Asp-Ser-Lys-Arg，即KRDS。KRDS 能選擇性抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，可抑制纖維蛋白原與αⅡbβ3 結(jié)合，該抑制作用與抑制致密顆粒釋放5-羥色胺有關(guān)，而與蛋白磷酸化無關(guān)。將從牛乳蛋白中分離出的四肽 KRDS 進(jìn)行構(gòu)象優(yōu)化得到KREE，其抗血小板活性高于早前發(fā)現(xiàn)的四肽KRDS 和RGDS。四肽RGDS可以抑制ADP 和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集，IC50值分別為32.3 μM 和13.75 μM。

       從鯖魚皮明膠酶解物中提取出抗血小板三肽FGN。從豬皮膠原的酶解物中提取出的三肽 GPR 抑制膠原和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，其 IC50值為250 μM。研究發(fā)現(xiàn)，膠原肽 GPR 及其衍生物能夠與纖維蛋白原結(jié)合并阻止纖連蛋白單體間發(fā)生聚合，從而選擇性抑制 ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集。同時動物實(shí)驗證實(shí)，靜脈注射或口服三肽 GPR 以及豬皮膠原的酶解物可以抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的患有彌散性血管內(nèi)凝血大鼠體內(nèi)的血小板數(shù)量減少，即口服該三肽可以對血小板聚集起到抑制作用。

       從少棘蜈蚣中提取和純化一種多肽SQL( Ser-Gln-Leu) ，分子質(zhì)量為346 Da， SQL濃度為0. 2～1. 0 mg /ml，可抑制 ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集，且呈劑量依賴性，同時，研究發(fā)現(xiàn)，SQL可有效延長活化部分凝血活酶時間( APTT) ，且呈劑量依賴性，而凝血酶原時間( PT) 不受影響，這可能是由于其對內(nèi)源性凝血途徑中的凝血因子(諸如XⅡa 因子、XIa 因子、X 因子活化酶復(fù)合體等) 發(fā)揮抑制作用，而不影響外源性凝血途徑。

       從棕點(diǎn)湍蛙皮膚分泌物中提取、純化一種多肽 ZDPI，該多肽由15個氨基酸組成 ( FRGC-WLKNYSPRGCL-NH2)，分子質(zhì)量為1798. 6 Da。ZDPI 在 8、16、32 μg /ml濃度下，可選擇性抑制 ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集，且呈劑量依賴性，經(jīng)計算 IC50為12.27 μg/ml。

       從水蛭中分離純化出一種多肽 WP-30，該多肽由30個氨基酸組成( VISRTQSNVQAAWGQVG-GHAADYSAVAIER)。WP-30可能通過干擾凝血酶及其受體的結(jié)合，從而選擇性抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，且呈劑量依賴性，其IC50 為445. 1uM。

       從蘄蛇毒水解物中提取和純化一種多肽ACH-11，該多肽由11個氨基酸組成( LTFPRIVFV-LG) ， ACH-11在0. 1～1. 0 mg /ml濃度范圍內(nèi)，可選擇性抑制ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集，且呈劑量依賴性，同時，F(xiàn)Xa酰胺水解活性測定發(fā)現(xiàn)，ACH-11可直接抑制FXa 或 FXa-底物復(fù)合物( Ki值為9. 02 uM) ，從而發(fā)揮抗凝血作用，此外，動物實(shí)驗發(fā)現(xiàn) ACH-11 具潛在體內(nèi)抗血栓形成作用。

       2、植物源抗血小板肽

       植物源抗血小板作用主要來自于中草藥中的多酚類物質(zhì)，而抗血小板多肽的相關(guān)研究較少。從藥用蘑菇 (樺褐孔菌 Inonotus obliquus ) 中提取、純化出三肽 WGC，可以抑制膠原和ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集，其抑制率高達(dá)91.6%，IC50值為0.16 mM。從大豆蛋白的水解產(chǎn)物中提純并鑒定了兩種活性最高的親水性抗血小板肽：SSGE 和 DEE。SSGE 和 DEE 的 IC50值分別為480、460 μM，均可以抑制 ADP 誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集。此外，大豆蛋白的水解物中多數(shù)組分具有抗血小板活性，表明水解物中的大多數(shù)肽具有抗血小板作用。從燕麥，青稞和蕎麥的酶解并模擬消化產(chǎn)物中提取出 38 條抗血小板肽，并從中篩選出了活性最高的 9 條肽：ALPIDVLANAYR，EFLLAGNNKR，GEEFGAFTPK，QLAQIPR，LQAFEPLR，ALPVDVLAN AYR，GEEFDAFTPK，QKEFLLAGNNK 和 TNPNSMVS HIAGK。所有水解產(chǎn)物均顯示出高抗血小板活性，并以劑量依賴性方式抑制血小板聚集，其中，燕麥球蛋白水解物的抗血小板活性最強(qiáng)，IC50值為0.282 mg /mL。

       3、微生物源抗血小板肽

       大多數(shù)重組的抗血小板肽選擇在酵母菌、枯草桿菌及大腸桿菌中表達(dá)，使工業(yè)化制備抗血小板肽成為可能。從噬菌體文庫中分離出的環(huán)狀九肽ACRGDGWCG，通過抑制整合素 αVβ1介導(dǎo)的受體與纖維蛋白原結(jié)合，從而抑制 ADP 和膠原誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集，IC50值為6μM。通過計算機(jī)模擬，環(huán)肽 ACRGDGWCG 的類似物 ACDCRGDCFCG 同樣具有較高的抗血小板活性。

       4、人工合成抗血小板肽

       依替巴肽是美國 FDA 批準(zhǔn)上市的第一種抗血小板多肽，其屬 GPIIb /IIIa 受體拮抗劑，為人工合成的環(huán)多肽，由7個氨基酸( Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys- NH2) 環(huán)繞而成，其活性基團(tuán)為賴氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，該基團(tuán)模擬與纖維蛋白原結(jié)合的序列，可競爭性抑制GPⅡb/Ⅲa 受體與纖維蛋白原結(jié)合，從而起到抗血小板聚集的作用。

       血小板整合素 αⅡbβ3與配體結(jié)合主要通過一個三肽序列，即 Arg-Gly-Asp ( RGD) 序列，RGD 廣泛存在于纖維蛋白原中，是黏附蛋白與細(xì)胞表面特異受體相作用的識別位點(diǎn)，RGD 序列相關(guān)肽可競爭性抑制 GPⅡb /Ⅲa 配體識別位點(diǎn)，阻斷纖維蛋白原與血小板結(jié)合，從而抑制血小板聚集。Z4A5 是人工合成的一種含2個 RGD 序列的小分子線性肽，Z4A5 能選擇性抑制 ADP、凝血酶、花生四烯酸( AA) 誘導(dǎo)的血小板聚集，且呈劑量依賴性，流式細(xì)胞術(shù)亦證實(shí)，Z4A5 能抑制纖維蛋白原與 GPⅡb /Ⅲa 的結(jié)合，從而表明 Z4A5 可能是通過抑制 GPⅡb/Ⅲa 受體而實(shí)現(xiàn)的抗血小板聚集作用。

       抗血小板治療在血栓性疾病的防治中具有重要作用。目前臨床上常使用的抗血小板藥物存在抗血小板療效不佳或增加出血風(fēng)險等問題，而新近發(fā)現(xiàn)的抗血小板作用的生物活性肽類化合物可抑制各種途徑誘導(dǎo)的血小板活化和聚集，為新型抗血小板藥物的研發(fā)提供了新的策略和依據(jù)。大量研究還發(fā)現(xiàn)其他具有抗血小板激活、聚集活性的肽段，除部分人工合成的肽類物質(zhì)會影響血小板功能外，多種食源性抗血小板肽也處于研發(fā)階段。而從食源性蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的具有抗血小板活性的小分子肽類化合物具有安全、可食用、營養(yǎng)、來源廣泛等特點(diǎn)，開發(fā)利用前景廣闊。

       參考資料

       [1]萬雯,孟照輝.血小板相關(guān)活性肽的研究進(jìn)展[J].臨床醫(yī)學(xué),2017,37(07):121-124.

       [2]田淇,李博.抗血小板活性肽及其作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2019,31(03):528-537.

       作者簡介：小米蟲，藥品質(zhì)量研究工作者，長期致力于藥品質(zhì)量研究及藥品分析方法驗證工作，現(xiàn)就職于國內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事藥品檢驗分析及分析方法驗證