與死神賽跑 快速微生物檢測技術(shù)的法規(guī)進(jìn)展

       按照WHO專家的話說，的風(fēng)險(xiǎn)就是患者有病卻沒有治療藥品。但是，如果有研發(fā)人員開發(fā)了藥品，但是要限于目前保守的法規(guī)質(zhì)控要求，不能及時(shí)讓患者獲得救命藥品，也是非常遺憾的。長期以來，各國藥典收載了很多評(píng)估藥品成品和原輔料的微生物檢測方法；這些方法為客觀評(píng)價(jià)藥品品質(zhì)，并協(xié)助制藥人員和監(jiān)管人員以判斷藥品質(zhì)量發(fā)揮了很大的作用。但是目前從最新觀點(diǎn)看，大部分藥典收載的微生物檢測反復(fù)都是保守和滯后的，因?yàn)檫@些檢測方法需要很長時(shí)間才可以給出最后檢測結(jié)果。拿無菌檢測為例，目前世界各國藥典都規(guī)定無菌藥品要培養(yǎng)14天，而這個(gè)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)于很多癌癥晚期患者而言，是非常難以忍受的煎熬。另外，有些藥品有效期很短，例如電子輻射類藥物；如果對(duì)于這些藥品都采用常規(guī)微生物檢測方法來判斷和實(shí)施放行，患者和制藥行業(yè)都要承受痛苦。

       為了解決這些矛盾，各國技術(shù)專家不斷開發(fā)和推出快速微生物檢測技術(shù)（RMM）。目前，USP推出一個(gè)新的技術(shù)附錄，詳細(xì)闡釋了對(duì)于效期較短的無菌藥品，如何做才是更合理的。這份文件的名稱是USP-1071《RAPID MICROBIAL TESTS FOR RELEASE OF STERILE SHORTLIFE PRODUCTS: A RISK-BASED APPROACH》，翻譯中文為《有效期較短的無菌產(chǎn)品放行的快速微生物測試-基于風(fēng)險(xiǎn)的方法》。

       筆者根據(jù)自己的理解，對(duì)全文進(jìn)行了翻譯和解析，希望可以為制藥行業(yè)以及亟待救命藥的患者提供幫助。

       1 介紹

       人們普遍認(rèn)為，目前生長型的無菌檢查法（培養(yǎng)期至少為14天）（見無菌檢查〈71〉）不適用于效期較短的產(chǎn)品或準(zhǔn)備立即使用的產(chǎn)品，這些產(chǎn)品通常在檢測完成前注入患者體內(nèi)。這些短效期產(chǎn)品包括調(diào)配無菌制劑（CSP）、正電子發(fā)射斷層掃描（PET）產(chǎn)品以及細(xì)胞和基因療法產(chǎn)品，它們需要新一代的基于風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括快速微生物測試。有關(guān)無菌檢查以外有助于無菌保證因素的一般討論，請參見無菌保證〈1211〉。應(yīng)注意的是，與其他替代測試方法一樣，如果發(fā)生爭議，仲裁采用的測試方法應(yīng)該符合USP〈71〉所列方法。

       如果進(jìn)行微生物檢測，在產(chǎn)品使用前完成檢測微生物污染的測試來確?；颊叩陌踩?/p>

       快速微生物檢測（RMTs）應(yīng)基于風(fēng)險(xiǎn)，這樣利益相關(guān)者可選擇適合其預(yù)期用途的首選技術(shù)，并平衡用戶需求規(guī)范（URS），包括出結(jié)果時(shí)間、特異性、檢測限（LOD）、樣本量和產(chǎn)品屬性。例如，許多**藥物，由于**示蹤劑的半衰期短，通過實(shí)時(shí)微生物檢測受益最多，而調(diào)配無菌制劑（CSPs）和細(xì)胞治療產(chǎn)品，由于會(huì)稍微超過使用日期，因此采用通宵檢測或至少在48小時(shí)內(nèi)完成檢測會(huì)使用戶受益。

       本章節(jié)是一般性信息，討論了生產(chǎn)/制備和檢測短效期產(chǎn)品的需求及其URS，并簡要討論了短效期的無菌產(chǎn)品放行的基于風(fēng)險(xiǎn)的快速微生物檢測的一些合適方法（本章下文稱為"短效期產(chǎn)品"）。

       2 無菌短效期產(chǎn)品放行的快速微生物測試的用戶要求規(guī)范

       短效期產(chǎn)品放行進(jìn)行快速微生物測試選擇合適的技術(shù)應(yīng)該是基于風(fēng)險(xiǎn)的決定。不同技術(shù)的URS包括：

       o用盡可能短的時(shí)間產(chǎn)生檢測結(jié)果，是實(shí)時(shí)的或少于24小時(shí)，是在產(chǎn)品給藥之前

       o檢測能力，在測試樣品中檢測到少于100CFU

       o能夠在產(chǎn)品中檢測多種活性微生物

       o樣本數(shù)量,即測試物品的最小數(shù)量和每個(gè)測試容器的數(shù)量，不會(huì)用完大部分的可用產(chǎn)品；

       在可行的情況下，制造商應(yīng)在工藝設(shè)計(jì)過程中考慮檢測要求

       o無菌測試材料處理，即封閉系統(tǒng)，以減少測試過程中的意外污染

       o可從多個(gè)供應(yīng)商獲得儀器和試劑

       o參考標(biāo)準(zhǔn)、陰性和陽性對(duì)照的可用性，適用于使用菌落形成單位以外信號(hào)的技術(shù)。

       o易于使用/測試和數(shù)據(jù)解釋簡單

       o假陽性和假陰性結(jié)果的發(fā)生率較低

       o針對(duì)每個(gè)特定產(chǎn)品的方法適用性測試策略

       o提高患者的安全性，主要在于：

       在給藥前完成測試

       提供無菌檢測不合格的逐步監(jiān)測和報(bào)告的測試

       o能夠識(shí)別檢測到的微生物，這可能對(duì)臨床醫(yī)生用藥以及調(diào)查確定其來源有用。

       o測試中使用的設(shè)備和試劑的耐用性和可靠性

       o樣品制備適用于手動(dòng)和自動(dòng)方法

       3 基于風(fēng)險(xiǎn)的微生物監(jiān)測和放行測試的概念

       對(duì)快速微生物檢測（RMT）的URS的審查表明，需要做出一些基于風(fēng)險(xiǎn)的決定，特別是在出結(jié)果的時(shí)間、LOD、樣本量以及檢測到的微生物范圍方面，以便在給藥前采用此類檢測。如果現(xiàn)行的無菌檢查不合適，利益相關(guān)者應(yīng)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以選擇RMT。

       受益的方面可能包括，例如：

       o當(dāng)產(chǎn)品給藥太晚對(duì)患者生存存在重大風(fēng)險(xiǎn)的情況下使用RMT。臨床文獻(xiàn)中的一個(gè)顯著例子是血液感染，這是一種快速進(jìn)行性感染，死亡率高達(dá)40%，并且每天延遲服用抗生素會(huì)導(dǎo)致死亡率增加10%。在這些情況下，在給藥前完成微生物測試顯然可以提高患者的安全性。

       o采用生長型的RMT，將連續(xù)讀數(shù)應(yīng)用于"到目前為止為陰性"的風(fēng)險(xiǎn)放行，因?yàn)榭梢愿绲貦z測到快速生長的微生物，如果檢測到不合格，這樣讓臨床醫(yī)生能夠更快地對(duì)患者進(jìn)行干預(yù)。當(dāng)檢測到被污染的產(chǎn)品時(shí)，實(shí)驗(yàn)室主管可以通知治療患者的臨床醫(yī)生，并可以開始血管內(nèi)液體復(fù)蘇和抗生素治療以避免感染性休克。因此，與培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)的單個(gè)讀數(shù)相比，逐步監(jiān)測并自動(dòng)報(bào)告不合格的無菌測試具有額外的優(yōu)勢。

       o使用LOD高于1 cfu的非生長型RMT，通過微生物培養(yǎng)基中的生長進(jìn)行擴(kuò)增，但產(chǎn)生結(jié)果的時(shí)間非?？臁６绦诋a(chǎn)品在給藥之前實(shí)時(shí)檢測污染的能力可能會(huì)認(rèn)為比在產(chǎn)品中檢測單個(gè)菌落形成單元更重要。當(dāng)考慮到對(duì)患者的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，RMT的選擇應(yīng)考慮到檢測靈敏度與檢測時(shí)間的關(guān)系。分析應(yīng)有合理的靈敏度，以檢測低水平污染物的存在，并應(yīng)在產(chǎn)品給藥前可獲得結(jié)果的時(shí)間框架內(nèi)進(jìn)行。

       o非生長型RMT方法的其他優(yōu)點(diǎn)還可能包括不受測試樣品中抗生素的影響，以及檢測培養(yǎng)陰性感染因子。一些DNA靶向抗生素（如多粘菌素B和桿菌肽）已被證實(shí)抑制了PCR擴(kuò)增，而青霉素G、氯霉素、兩性霉素和納利地西酸等抗生素不影響反應(yīng)的分辨能力。這對(duì)于生產(chǎn)抗生素注射溶液的無菌配制藥房來說是最重要的。方法適用性應(yīng)確定供試品中是否有抗生素會(huì)影響測定。

       此外，在最終產(chǎn)品放行無菌檢查之前，可將RMTS或其他快速微生物方法（RMMs）用于中控之中，以更快地提供有關(guān)微生物控制的有效性和對(duì)總污染的早期檢測的信息（以便調(diào)查和盡快啟動(dòng)生產(chǎn)）或產(chǎn)品可能無菌不合格的可能性。

       對(duì)于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，一個(gè)可能被忽視的考慮因素是根據(jù)注射或注入的產(chǎn)品的數(shù)量和給藥部位對(duì)病人的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。注入體積越大，侵入性越強(qiáng)，患者的血流感染風(fēng)險(xiǎn)就越大。風(fēng)險(xiǎn)范圍從少量的皮內(nèi)注射到大量的靜脈注射(見表1)。

       表1. 按給藥途徑和相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)水平劃分的典型注射量

       4 用于確定無菌短效期產(chǎn)品放行的基于風(fēng)險(xiǎn)的快速微生物試驗(yàn)的關(guān)鍵操作參數(shù)

       預(yù)計(jì)的操作參數(shù)，即表2中列出的適用于RMT的備選技術(shù)的LOD、出結(jié)果的時(shí)間以及樣本量。

       表2 備選的快速微生物技術(shù)的操作參數(shù)

       對(duì)于這些方法，信號(hào)將以基因組單位表示。

       5 〈71〉不適用于產(chǎn)品放行檢測時(shí)樣本大小的考慮

       根據(jù)技術(shù)的樣品處理能力或保存急需產(chǎn)品的需要，可能需要縮減樣本大小。

       每種培養(yǎng)基所使用的產(chǎn)品的最小數(shù)量以及與批量相關(guān)的待測單元的最小數(shù)量見< 71 >，表2和表3。人們普遍認(rèn)為，對(duì)于大批量的制藥產(chǎn)品，檢測的單位數(shù)量并不是基于統(tǒng)計(jì)的，而且在每個(gè)產(chǎn)品批次中檢測低污染水平的能力較低。然而，隨著許多效期較短的產(chǎn)品的批量變小，這一限制將會(huì)減少，因?yàn)闇y試的產(chǎn)品相對(duì)于批量的比例將會(huì)增加。

       這種傳統(tǒng)的取樣計(jì)劃不適用于細(xì)胞治療產(chǎn)品。例如，如果準(zhǔn)備了10個(gè)單獨(dú)的60毫升的靜脈注射（IV）細(xì)胞袋，那么將取4個(gè)樣品袋，每個(gè)樣品袋取20毫升。采用這種抽樣方案，40%的批次將被用于無菌檢查，這不僅是巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且更重要的是，治療產(chǎn)品的巨大損失，可能會(huì)影響對(duì)患者的足量給藥劑量。相反，如果40個(gè)1毫升的西林瓶用于注射用藥品4萬瓶批次的無菌檢查，這只占該批次的0.1%。

       減少樣本量和檢測單位數(shù)量將降低無菌檢查的靈敏性。表3和表4說明了對(duì)藥品和調(diào)配無菌制劑（CSP）測試的相對(duì)不敏感性。

       表3 藥品20單位的無菌檢查通過給定的不斷增加的污染率的概率

       根據(jù)以下進(jìn)行計(jì)算

       p = (1 - p)²⁰ = q²⁰

       p = 批次中污染的比例

       q = 批次中未污染的比例

       表4 無菌調(diào)配制劑（CSP）6單位的無菌檢查通過給定的不斷增加的污染率的概率

       其他藥典中也提出了替代的抽樣計(jì)劃。歐洲藥典9.0章第2.6.27細(xì)胞制劑微生物學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)了一種批量小于40個(gè)單位的細(xì)胞治療產(chǎn)品無菌檢查的推薦方法。

       容量在10 ~ 1000ml的細(xì)胞制劑的污染試驗(yàn)樣品量為總?cè)萘康?%;容量在1 ~ 10ml的細(xì)胞制劑，樣品量為0.1 mL;對(duì)于小于1ml的細(xì)胞制劑，該制劑將不進(jìn)行檢測。如21 CFR 610.12(無菌)中所建議的，在完全合理的情況下，可使用快速方法進(jìn)行中控檢測，以代替最終產(chǎn)品檢測。

       與細(xì)胞治療制劑類似，PET**藥物的樣品量和采樣計(jì)劃也必須適應(yīng)有限的瓶數(shù)(通常為一個(gè))和批次中生產(chǎn)的產(chǎn)品容量(通常小于15毫升)。如果該批次由單個(gè)容器組成，則無菌檢查樣品量至少為該批次總?cè)萘康?%。例如，如果一個(gè)批次是1瓶含有15毫升，至少使用0.15毫升用于無菌檢查。如果該批次由多個(gè)容器組成，則使用單個(gè)容器的量至少占整個(gè)批次容量的1%。如果每批由3個(gè)小瓶組成，每個(gè)小瓶含有25毫升，則至少從1小瓶中取0.75毫升用于無菌檢查。

       檢測限

       在用一個(gè)或多個(gè)菌落形成單元的細(xì)胞懸浮液制備接種物的限制條件下，生長型的無菌檢查顯示根據(jù)泊松分布理論檢出限至少為1-3 cfu。對(duì)所有技術(shù)設(shè)置單個(gè)活細(xì)胞的LOD，對(duì)于任何無菌檢查方法來說都是設(shè)置了不切實(shí)際的使用障礙，尤其是當(dāng)信號(hào)不是通過培養(yǎng)的濃縮而放大的菌落形成單元時(shí)。

       檢測多種微生物的能力

       盡管所有的分析平臺(tái)都應(yīng)能夠檢測各種各樣的細(xì)菌、酵母菌和霉菌，但證實(shí)快速微生物檢測（RMT）選擇的技術(shù)能夠檢測與無菌檢查不合格、爆發(fā)感染以及與CSP、**藥物、細(xì)胞療法或制劑相關(guān)的產(chǎn)品召回有關(guān)的微生物，這一點(diǎn)是非常重要的。風(fēng)險(xiǎn)分析后，如果該技術(shù)顯示能夠通過向獨(dú)立利益相關(guān)患者給藥，并提高患者的安全性，則情況尤其如此。

       6 無菌短效期產(chǎn)品放行快速微生物檢測方法

       根據(jù)與上文討論的URS的匹配情況，適用于RMT推薦的技術(shù)，按字母順序列出如下：

       o三磷酸腺苷（ATP）生物發(fā)光

       o流式細(xì)胞術(shù)

       o恒溫微量熱量測定法

       o核酸擴(kuò)增

       o呼吸

       o固相細(xì)胞術(shù)

       技術(shù)簡介

       分別對(duì)這些備選的高級(jí)分析平臺(tái)進(jìn)行了簡要討論，并提供了關(guān)鍵參考。有關(guān)概述，請參閱Moldenhauer

       三磷酸腺苷生物發(fā)光

       這是一項(xiàng)成熟的技術(shù)，有多種儀器制造商提供的光度計(jì)和試劑。活細(xì)胞的能量以ATP的形式儲(chǔ)存，當(dāng)接觸美國螢火蟲的熒光素酶時(shí)，可以以光的形式測量。熒光素酶消耗的每個(gè)ATP分子產(chǎn)生一個(gè)光子。

       光度計(jì)檢測到的結(jié)果通常以相對(duì)光單位（RLU）表示，并且結(jié)果依賴儀器、試劑和有機(jī)體。不同微生物的ATP含量范圍為革蘭氏陰性菌2～4×10～18摩爾/cfu，革蘭氏陽性菌5～8×10～18摩爾/cfu，真菌300～800×10～18摩爾/cfu。在微生物培養(yǎng)基中，由于測量的高信噪比和背景ATP，肉湯中微生物相關(guān)儀器的檢測限約為5000 RLU，相當(dāng)于約10 ³ CFU。

       這一LOD將檢測微生物的存在，其水平與目視檢測培養(yǎng)基生長所需的水平相比，低3-4個(gè)對(duì)數(shù)水平。無菌短效期產(chǎn)品放行的快速微生物試驗(yàn)，無論是在液體培養(yǎng)基中達(dá)到閾值A(chǔ)TP水平的濃縮培養(yǎng)，還是在固體培養(yǎng)基上的膜過濾器上形成微生物菌落的濃縮培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間均可達(dá)到2-7天。

       流式細(xì)胞術(shù)

       流式細(xì)胞術(shù)可用于在24-48 h的濃縮培養(yǎng)后檢測熒光標(biāo)記的活菌細(xì)胞。標(biāo)記試劑由熒光基質(zhì)或活菌染色劑組成，用于區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。雖然細(xì)菌非常小，可能很難從細(xì)胞碎片中區(qū)分出來，但它們可以通過大小、形狀和熒光強(qiáng)度來區(qū)分。細(xì)胞存活能力是指完整的細(xì)胞膜保留由非特異性細(xì)胞酯酶產(chǎn)生的熒光色素的能力，或用核酸特異性生命染色標(biāo)記細(xì)胞。激光照射流中的每個(gè)細(xì)胞以及發(fā)出的光由雙光電倍增管陣列檢測。信號(hào)經(jīng)過數(shù)字化處理，并由識(shí)別軟件進(jìn)行解釋。該技術(shù)的LOD可能是>1 cfu并且可能需要一個(gè)濃縮步驟。

       恒溫微熱量計(jì)

       恒溫微熱量計(jì)監(jiān)測與微生物代謝活性和生長有關(guān)的密閉小瓶（系統(tǒng)）的焓變化。利用現(xiàn)有的儀器，10⁴個(gè)活性微生物細(xì)胞可以釋放足夠的熱量進(jìn)行檢測并且檢測需要濃縮（出結(jié)果需2-7天）。盡管其在無菌產(chǎn)品放行測試中的具體應(yīng)用尚未確定，但最近它在藥物微生物學(xué)中的應(yīng)用已經(jīng)得到了評(píng)估。

       核酸擴(kuò)增技術(shù)

       實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）有可能通過36-48個(gè)擴(kuò)增周期監(jiān)測PCR的指數(shù)階段，使用通用引物和探針（稱為"泛細(xì)菌"和"泛真菌"方法）估計(jì)目標(biāo)DNA的初始數(shù)量，即反過來，與試驗(yàn)樣品中微生物細(xì)胞的數(shù)量成比例。與DNA不同的是，細(xì)胞RNA的代謝速度很快，可以更好地指示活的微生物。

       例如，大腸桿菌每個(gè)細(xì)胞含有2個(gè)DNA分子和2×10⁴個(gè)16S rRNA分子。這一過程是通過酶逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)化為DNA（cDNA）的互補(bǔ)拷貝來實(shí)現(xiàn)的，cDNA可以通過定量（計(jì)數(shù)試驗(yàn)）或定性（無菌檢查）實(shí)時(shí)分析。或者，對(duì)于基于DNA的PCR，用單疊氮化物或單疊氮化物丙啶預(yù)處理的樣品也可以提供區(qū)分活的和死的微生物細(xì)胞的能力，或者可以通過離心/洗滌步驟從試驗(yàn)樣品中去除游離的微生物DNA，包括從分析用細(xì)菌顆粒中去除游離的微生物DNA。

       實(shí)際上，單個(gè)活細(xì)胞的LOD可能是一個(gè)不可克服的挑戰(zhàn)，尤其是對(duì)于依賴DNA/RNA靶和通用性引物的測試而言。

       另一個(gè)挑戰(zhàn)是不同微生物中不同數(shù)量的基因組物質(zhì)。

       一般情況下，LOD在樣本中范圍為10到1000個(gè)活細(xì)胞/mL，另外在一些報(bào)告病例中范圍為10到100個(gè)活細(xì)胞/mL。最近的研究表明，PCR實(shí)際上可以在不需要在微生物生長培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)的情況下，在含有高達(dá)10個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞/mL的高濃度樣品中檢測到10 - 10 cfu/mL的微生物。增加生長型的濃縮步驟至少24-48 h并且比較培養(yǎng)前后PCR結(jié)果，可為無菌檢查提供實(shí)用的解決方案。

       另外，還可以采用濃度法來富集樣品，減少樣本體積。如上所述的最近的一項(xiàng)研究的作者使用16 s rRNA PCR對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行無菌檢查,證明細(xì)菌靈敏度為10 - 100 cfu / mL,測試方法靈敏度100 cfu /毫升將適合檢測臨床顯著細(xì)菌污染的血液和細(xì)胞制品。

       生長型和核酸擴(kuò)增型檢測方法的直接比較是復(fù)雜的，因?yàn)楹怂釘U(kuò)增型檢測方法也檢測非活性的生物體，而且是對(duì)微生物基因組拷貝數(shù)的測量，而不是菌落形成單位。因此，核酸擴(kuò)增型檢測LOD應(yīng)根據(jù)每毫升基因組當(dāng)量來定義。

       用于無菌短效期產(chǎn)品（如核酸擴(kuò)增）放行的非生長型RMT由于以下原因可能具有其他優(yōu)勢：

       o接近實(shí)時(shí)的檢測，將在短效期產(chǎn)品注入患者體內(nèi)前完成檢測

       o檢測培養(yǎng)陰性感染因子

       o如本章前面所述，測試樣本中抗生素對(duì)測試的影響最小

       o與其他技術(shù)相比，該測試對(duì)動(dòng)物細(xì)胞裂解(如顆粒、ATP)產(chǎn)生的背景不太敏感，因?yàn)樘囟ǖ奈⑸锘蚴前邢虻?/p>

       呼吸類技術(shù)

       這一大類包括從經(jīng)典呼吸計(jì)，到氣體頂空分析儀，再到自動(dòng)血液培養(yǎng)系統(tǒng)。好氧和厭氧肉湯配方考慮到了5天的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)可以回收引起血流感染的大多數(shù)微生物的回收率。在一些儀器中，這包括如〈71〉中20°-25°和30°-35°的培養(yǎng)。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)成功地?cái)U(kuò)展到細(xì)胞治療產(chǎn)品的無菌檢查，采用7天的培養(yǎng)作為批次放行藥典無菌檢查的替代方法。

       其他可用于檢測和計(jì)數(shù)呼吸微生物的儀器。例如，可調(diào)諧二極管激光吸收光譜（TDLAS）可以測量培養(yǎng)基中含有生長微生物的封閉單元中的氧（O）消耗或二氧化碳（CO）增加。該技術(shù)最初是為監(jiān)測密閉裝置中的氣體頂空成分而開發(fā)的，也可用于自動(dòng)介質(zhì)填充檢查。系統(tǒng)具有氣體校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，如果系統(tǒng)用于無菌檢查（例如，對(duì)大容量容器進(jìn)行校準(zhǔn)），則需要進(jìn)行較小的調(diào)整。

       [注：呼吸平臺(tái)的所有系統(tǒng)都需要微生物生長和代謝活性進(jìn)行檢測，即通常需要2-7天的時(shí)間才能獲得結(jié)果。但是，如果結(jié)果可以逐步監(jiān)測，在培養(yǎng)期間早先檢測到無菌檢查不合格，這對(duì)于上述風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估部分所述的短效期產(chǎn)品是一個(gè)巨大的優(yōu)勢。]

       固相細(xì)胞術(shù)

       有基于固相細(xì)胞術(shù)的儀器系統(tǒng)，結(jié)合熒光標(biāo)記和固相激光掃描，可快速計(jì)數(shù)可過濾液體中的活微生物。通過過濾0.45微米聚酯膜收集微生物，并用背景和活性染料進(jìn)行處理。用高速488nm氬激光在細(xì)胞儀中掃描濾光片。多個(gè)光電倍增管，經(jīng)過處理以區(qū)分標(biāo)記微生物和背景噪聲，根據(jù)大小、形狀和熒光強(qiáng)度，檢測熒光。掃描顯示為一張地圖，用于識(shí)別熒光事件的位置，使用帶自動(dòng)機(jī)動(dòng)化臺(tái)的表觀熒光顯微鏡來確定單個(gè)事件的位置。該系統(tǒng)聲稱能在2-3小時(shí)內(nèi)檢測到單個(gè)的活微生物。應(yīng)該注意的是，大多數(shù)細(xì)胞治療產(chǎn)品都是不可過濾的，因此該技術(shù)可能與這些類型的產(chǎn)品不兼容。

       7 方法適用性測試

       生長型無菌試驗(yàn)的方法適用性要求見〈71〉。必須要證明每個(gè)待測試產(chǎn)品的測試適用性。在殘留產(chǎn)品存在的情況下，USP在低于100 cfu的水平上挑戰(zhàn)生物體的回收率，被證明為直接接種或膜過濾法的微生物生長介質(zhì)中明顯可見生長。除了源自實(shí)驗(yàn)室的菌落形成單元以外的信號(hào)培養(yǎng)（例如，核酸、ATP和活微生物細(xì)胞的熒光標(biāo)記），測試實(shí)際樣品的結(jié)果可能會(huì)得出與使用其他技術(shù)不相同的結(jié)果。然而，方法適用性測試將確認(rèn)分析物中的產(chǎn)品殘留物不會(huì)抑制與快速方法產(chǎn)生信號(hào)相關(guān)的酶促步驟。

       8-術(shù)語（省略）

       9-參考文獻(xiàn)（省略）

       作者簡介：zhulikou431，高級(jí)工程師、PDA會(huì)員、ISPE會(huì)員、ECA會(huì)員、PQRI會(huì)員、資深無菌GMP專家，在無菌工藝開發(fā)和驗(yàn)證、藥品研發(fā)和注冊、CTD文件撰寫和審核、法規(guī)審計(jì)、國際認(rèn)證、國際注冊、質(zhì)量體系建設(shè)與維護(hù)領(lǐng)域，以及無菌檢驗(yàn)、環(huán)境監(jiān)控等領(lǐng)域皆具有較深造詣。近幾年開始著力關(guān)注制藥宏觀領(lǐng)域趨勢分析和制藥企業(yè)并購項(xiàng)目的風(fēng)險(xiǎn)管理工作。