天然產(chǎn)物抗念珠菌作用機(jī)制研究進(jìn)展（上）

       念珠菌感染是臨床最常見的機(jī)會(huì)性真菌感染之一，好發(fā)于老年人群、癌癥化療、移植術(shù)后、HIV感染等免疫低下人群。由于唑類、多烯類、棘白菌素類等傳統(tǒng)抗真菌劑的廣泛使用，天然耐藥性念珠菌株的出現(xiàn)以及非白念珠菌感染比例增加，臨床念珠菌耐藥現(xiàn)象日漸嚴(yán)重。天然產(chǎn)物以其獨(dú)特的化學(xué)多樣性和生物活性而聞名，幾個(gè)世紀(jì)以來一直被廣泛用于治療各種疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，臨床的一線抗真菌藥物通常是天然產(chǎn)品或其衍生品。近年來，抗真菌天然產(chǎn)物的開發(fā)取得了重大進(jìn)展，已發(fā)現(xiàn)相當(dāng)數(shù)量的天然分子對不同種類的念珠菌具有治療作用。如從植物組織中提取出的化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的生物活性分子及其衍生物對多種念珠菌具有顯著抑制作用，且具有來源廣泛、不良反應(yīng)小、適合長期或預(yù)防性使用等多方面優(yōu)勢，成為新型抗真菌劑的重要來源。

       抗念珠菌天然產(chǎn)物中，真菌代謝物是主要來源，其次是植物。這些化合物大多屬于生物堿、聚酮類、萜類、酚類、大環(huán)內(nèi)酯類和多肽類。其中，萜類化合物含量最高，其次是生物堿和聚酮類化合物。①萜類化合物主要是高等植物和內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物，具有抗念珠菌活性的萜類化合物包括單萜、倍半萜、二萜和三萜。研究表明，從有柄靈芝中分離的14種三萜類化合物增加了耐氟康唑白念珠菌對氟康唑的敏感性，其中部分能明顯抑制白念珠菌。從樟子松揮發(fā)油中分離出的倍半萜對白念珠菌、光滑念珠菌及克柔念珠菌均有抑菌作用。②生物堿是存在于生物體內(nèi)的含氮堿性化合物，具有顯著的生物活性。抗念珠菌的生物堿種類繁多，主要包括吲哚類、吡啶類、喹諾酮類等。吲哚類及喹諾酮類具有相對廣泛的抗真菌譜，但它們的抑菌活性通常是中等。相比之下，已報(bào)道的吡啶生物堿顯示出很強(qiáng)的抗真菌活性。③聚酮類抗念珠菌的聚酮類化合物大部分是從真菌代謝產(chǎn)物中分離得到的。如從紅樹植物內(nèi)生真菌莖點(diǎn)霉屬中分離得到部分聚酮化合物對白念珠菌顯示較強(qiáng)的抗菌活性，MIC50值為2.62μg/mL。

       天然產(chǎn)物抗念珠菌的作用機(jī)制

       天然產(chǎn)物抗念珠菌的作用機(jī)制主要包括抑制念珠菌毒力因子，如抑制念珠菌黏附與侵襲、酵母態(tài)-菌絲態(tài)形態(tài)轉(zhuǎn)換、生物膜形成、水解酶合成與分泌等；影響念珠菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和線粒體等細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化；誘導(dǎo)念珠菌細(xì)胞凋亡；抑制念珠菌藥物靶酶與外排泵表達(dá)；此外也有部分天然產(chǎn)物通過調(diào)節(jié)免疫增強(qiáng)抗念珠菌作用。

       1、抑制黏附與侵襲作用

       白念珠菌的黏附是其發(fā)揮侵襲作用及形成生物膜的關(guān)鍵性第一步，植物活性成分抗念珠菌黏附作用可主要通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。即通過將念珠菌與口腔黏膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察在植物活性成分作用下，念珠菌在口腔黏膜上皮細(xì)胞表面的黏附情況。研究發(fā)現(xiàn)，400μg/mL 丹皮酚和1μg/mL氟康唑單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，白念珠菌對人口腔黏膜上皮細(xì)胞的黏附率分別為(93.33±4.84)%與(91.67±3.45)%，而聯(lián)合應(yīng)用時(shí)其黏附率僅為(38.33±1.51)%，表明丹皮酚可與氟康唑協(xié)同抑制白念珠菌對人口腔黏膜上皮細(xì)胞的黏附。此外，研究表明，肉桂醛、小檗堿單獨(dú)使用以及與氟康唑聯(lián)用時(shí)，既可抑制白念珠菌芽管形成，還可顯著抑制其對人口腔黏膜上皮細(xì)胞的黏附。其機(jī)制為肉桂醛、小檗堿與氟康唑協(xié)同干擾了白念珠菌芽管胞壁蛋白的合成及其相關(guān)基因的調(diào)控，從而抑制了白念珠菌芽管的形成，并降低了其對宿主細(xì)胞的黏附能力。另有學(xué)者通過選取人克隆結(jié)直腸腺癌細(xì)胞系(Caco-2)與白念珠菌共培養(yǎng)，并采用細(xì)胞膜探針(DiI) 染色法，評(píng)估了網(wǎng)脊衣酸 B對白念珠菌侵襲宿主細(xì)胞能力的影響。結(jié)果表明，網(wǎng)脊衣酸B與氟康唑單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞內(nèi)菌絲侵襲率分別為(68±34)%及(57±16)%，而當(dāng)兩種藥物聯(lián)用后，細(xì)胞內(nèi)菌絲侵襲率可顯著減少至(25±16)%，證實(shí)植物活性成分網(wǎng)脊衣酸B具有抗念珠菌侵襲作用。

       2、抑制酵母態(tài)-菌絲態(tài)形態(tài)轉(zhuǎn)換

       酵母態(tài)-菌絲態(tài)形態(tài)轉(zhuǎn)換是白念珠菌發(fā)揮致病性的基礎(chǔ)。白念珠菌可通過由酵母態(tài)轉(zhuǎn)化為菌絲態(tài)，對宿主細(xì)胞產(chǎn)生黏附、穿刺和侵襲作用，進(jìn)而發(fā)揮其致病性。涉及到的相關(guān)信號(hào)通路主要包括：cAMP/PKA信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Rim101介導(dǎo)的pH信號(hào)通路、及Tup1介導(dǎo)的負(fù)調(diào)通路等。研究顯示，當(dāng)血根堿濃度為0.8μg/m時(shí)，Spider培養(yǎng)基中的白念珠菌全部保持酵母態(tài)，未見菌絲生成；而當(dāng)血根堿濃度達(dá)1.6μg/mL時(shí)，白念珠菌cAMP信號(hào)通路相關(guān)基因ALS3、HWP1、ECE1、HGC1、CYR1 的表達(dá)水平均顯著下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，4μg/mL 的厚樸酚與和厚樸酚可顯著抑制白念珠菌菌絲形成，當(dāng)其濃度達(dá)到16μg/mL時(shí)，Spider培養(yǎng)基中的白念珠菌未見菌絲生成，其可能機(jī)制為厚樸酚與和厚樸酚抑制了Ras1-cAMP-Efg1信號(hào)通路相關(guān)基因RAS1、EFG1、TEC1 和CDC35 的表達(dá)。群體感應(yīng)分子法尼醇可通過抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，作用于Ras1-Cyr1-cAMPEfg1信號(hào)通路，進(jìn)而抑制念珠菌酵母態(tài)-菌絲態(tài)形態(tài)轉(zhuǎn)換及生物膜形成；而酪醇則可以促進(jìn)其菌絲及生物膜形成。另有研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯可影響白念珠菌群體感應(yīng)分子法尼醇與酪醇的分泌量，并且對法尼醇呈負(fù)調(diào)作用，對酪醇呈正調(diào)作用，且該成分可使群體感應(yīng)分子編碼基因CHK1和PBS2明顯下調(diào)，最終對白念珠菌酵母態(tài)-菌絲態(tài)形態(tài)轉(zhuǎn)換及生物膜形成產(chǎn)生顯著抑制作用。

       3、天然產(chǎn)物對念珠菌生物膜的影響

       念珠菌生物膜的形成過程可大致分為4個(gè)階段：宿主表面黏附；念珠菌細(xì)胞的增殖；菌絲形成及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生；生物膜成熟后菌體的擴(kuò)散及其他部位的定植。研究顯示，植物活性成分的抗念珠菌作用機(jī)制包括抑制念珠菌生物膜形成過程、破壞念珠菌生物膜空間結(jié)構(gòu)、影響念珠菌生物膜細(xì)胞擴(kuò)散等。研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿對白念珠菌、克柔念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌生物膜的初始形成期至成熟期(6h、12h、24h、48h)均有抑制作用，其中對48h生物膜抑制作用最強(qiáng)。激光共聚焦顯微鏡及3D 重建后觀察發(fā)現(xiàn)，小檗堿可顯著破壞生物膜的空間結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞排列松散，密度降低，生物膜厚度變薄。

       黃芩素是黃芩的主要活性成分，研究表明它可通過減少CSH1的表達(dá)而降低生物膜的表面疏水性，從而減少黏附，抑制白念珠菌生物膜的形成。從苔蘚類植物中提取的具有大環(huán)雙聯(lián)芐結(jié)構(gòu)的化合物Riccardin D可通過下調(diào)菌絲特異基因ALS1、ALS3、ECE1、EFG1、HWP1和CDC35的表達(dá)并抑制了Ras-cAMP-EFG途徑，從而延緩了菌絲的形成，導(dǎo)致生物膜成熟缺陷。蓮堿是從天仙藤莖中分離得到的一種異喹啉類生物堿，通過相似途徑發(fā)揮抗念珠菌生物膜作用。酸模屬植物根部提取的nepodin通過抑制菌絲和生物膜相關(guān)基因(ECE1、HGT10、HWP1和UME6)的表達(dá)以及增加運(yùn)輸基因(CDR4、CDR11和TPO2)的表達(dá)可抑制白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌等念珠菌生物膜的形成。大葉藤黃中分離得到的二苯甲酮類化合物xanthochymol和garcinol，能有效地抑制芽管萌發(fā)，誘導(dǎo)早期和成熟的生物膜細(xì)胞凋亡，從而直接殺死菌絲和生物膜。

       4、抑制水解酶合成與分泌

       白念珠菌毒力相關(guān)水解酶主要包括分泌性天冬氨酸蛋白酶(secretedaspartylproteinase，Sap)、磷脂酶 (phospholipase，PL) 和脂肪酶 (lipase，Lip)等。水解酶可介導(dǎo)白念珠菌黏附、侵襲宿主細(xì)胞，同時(shí)還可裂解宿主免疫應(yīng)答相關(guān)分子，協(xié)助白念珠菌逃避宿主的免疫防御機(jī)制。多種植物活性成分可通過下調(diào)水解酶相關(guān)編碼基因，抑制水解酶合成，進(jìn)而減少其分泌。研究發(fā)現(xiàn)紫草素可呈濃度依賴性抑制白念珠菌磷脂酶分泌，8μg/m的紫草素可使PLB1和PLB2 基因的相對表達(dá)量降低56.4%和 61.4%，且16μg/mL 的紫草素可使白念珠菌磷脂酶分泌量下降56.3%。另有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)魚腥草素鈉濃度達(dá)240 mg/L時(shí)，可顯著抑制磷脂酶編碼基因PLB1和PLB2的表達(dá)。與此相反，一些植物活性成分還可通過上調(diào)水解酶相關(guān)基因表達(dá)而發(fā)揮作用。

       參考資料

       [1]余宇,佘曉東,劉維達(dá).抗念珠菌天然產(chǎn)物的研究進(jìn)展[J].中國真菌學(xué)雜志,2023,18(02):183-187.

       [2]解雨飛,周培茹,華紅等.植物活性成分抗念珠菌作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國真菌學(xué)雜志,2022,17(04):315-318+329.

       作者簡介：小米蟲，藥品質(zhì)量研究工作者，長期致力于藥品質(zhì)量研究及藥品分析方法驗(yàn)證工作，現(xiàn)就職于國內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事藥品檢驗(yàn)分析及分析方法驗(yàn)證。