簡述上市核酸藥物及其作用機制研究進展

       隨著核酸分子結構和功能的不斷闡明及核酸合成技術的提高和成本的大幅度下降，核酸研究和藥物創(chuàng)新逐漸成為精準生物醫(yī)學和疾病治療的熱點。核酸也因其獨特的化學生物學功能成為醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的新星。經(jīng)過不懈的努力探索，近年來，核酸藥物已在病毒、高膽固醇、基因表達編輯、視覺失明和肝靜脈阻塞等類疾病治療中嶄露頭角，體現(xiàn)出核酸藥物領域的巨大潛力和優(yōu)勢。核酸藥物通常由天然或修飾的脫氧核糖核苷或核糖核苷聚合而成，包括 DNA、RNA、反義寡核苷酸(ASOs)和核酸適配體等。目前，研究進展較快且已在臨床中應用的核酸藥物主要有ASOs、siRNA、mRNA和核酸適配體。

       1、ASOs藥物

       反義寡核苷酸（ASOs）是一種常見的DNA類藥物，通常為長度13~30堿基的單鏈短DNA 序列。ASO通過利用與靶基因互補的寡核苷酸序列，在靶點位形成 DNA/RNA 雙鏈結構，導致基因功能被抑制。ASO 除了靶向 mRNA 基因，也可以靶向Micro RNA（miRNAs），其中靶向miRNA的ASO被稱為antimir 或antagomir。ASO 發(fā)揮作用的方式不僅可以通過形成一個強大的雙鏈結構導致空間位阻，還可以誘導 RNase H切割 RNA鏈。RNase H是一種內源性酶，能夠識別DNA/RNA 雙鏈，并特異地切割RNA 鏈。因此，ASOs形成的雙鏈可以催化RNase H的定向切割。

       ASOs 的研究早于其他核酸藥物，迄今為止，被 FDA 批準上市的反義核酸藥物有9種，有2款早期的ASO藥物由于銷售額過低等原因退市，目前仍在市場的有7款。

       Vitravene于1998年批準上市，是FDA批準的首例上市核酸藥物，用于治療免疫功能低下患者(主要指艾滋病患者) 的巨細胞病毒性視網(wǎng)膜炎。其可與巨細胞病毒(CMV)CMV-IE2的 mRNA 特異性結合，然后RNase H 識別并水解靶向mRNA，最終導致CMV復制所必須的蛋白質IE2合成受阻，從而抑制CMV的增殖并達到治療效果。由于高活性抗逆轉錄病毒療法(HAART) 的快速發(fā)展，巨細胞病毒的病例數(shù)量急劇下降，目前本品已停止上市。

       2013年1月，F(xiàn)DA 批準Kynamro用于治療純合子家族性高膽固醇血癥(HoFH)。低密度脂蛋白( LDL) 顆粒過多是導致動脈粥樣硬化的關鍵，而載脂蛋白B100 (ApoB-100) 是運載這些脂蛋白顆粒的主要蛋白，因此以ApoB100作為藥物靶點是治療HoFH 的最重要的突破口。Kynamro的靶標為ApoB-100 mRNA，其可特異結合于ApoB-100 mRNA，RNase H通過特異水解ApoB-100 mRNA 使 ApoB-100 合成受阻從而降低膽固醇，目前本品也已停止上市。

       2016年9月，EXONDYS 51（eteplirsen）被FDA批準上市，成為第1個獲批治療杜氏肌營養(yǎng)不良癥(DMD)的磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸。DMD患者是由于DMD 基因突變，造成前信使 RNA( Pre-mR-NA) 形成 mRNA 過程中一或數(shù)個外顯子移除，改變編碼閱讀框，終止密碼子提前而不能表達功能性抗萎縮蛋白( atrophy protein)。eteplirsen 可與該蛋白PremRNA的外顯子51 特異性結合，在 Pre-mRNA 剪接過程中去除外顯子51，恢復下游閱讀框并產(chǎn)生截短且有部分功能的抗肌萎縮蛋白，達到治療的效果。

       2016年12月23日，Spinraza（nusinersen）被FDA批準用于脊髓性肌萎縮(SMA)治療。。SMA是由于 SMN1 基因功能缺失性突變導致，人類中有類似于SMN1 基因的拷貝-SMN2基因，SMN2基因可編碼無外顯子7的不穩(wěn)定蛋白( SMN△7) 。此藥物可特異穩(wěn)定地結合于SMN2 Pre-mRNA 外顯子7下游的內含子剪接消 音 器( ISS-N1) 上，阻止 SMN2 外顯子7被剪切，使包含有外顯子7的SMN2 mRNA 轉錄本的量和全長SMN 蛋白的量上調而達到藥物作用。2019年2月，Spinraza（nusinersen）獲批在中國上市，成為了國內第一個治療SMA的藥物。

       2018年，Tegsedi（inotersen）獲批上市，用于遺傳性轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（hATTR）成人患者，治療其第1階段或第2階段多發(fā)性神經(jīng)病變。Tegsedi可抑制TTR蛋白（包括突變型和野生型）的生成。Tegsedi顯示的臨床益處與甲狀腺素（TTR）蛋白的大量降低有關，這是hATTR淀粉樣變性的內在病因。Tegsedi與血小板減少癥和腎小球腎炎風險相關，需要加強監(jiān)測以支持對這些風險的早期識別和管理。

       2019年，Waylivra (volanesorsen)批準上市，用于治療家族性乳糜微粒血癥綜合征（FCS）的藥物，F(xiàn)CS是一種罕見的遺傳性疾病，由脂蛋白脂肪酶（LPL）功能受損引起，患有FCS的患者可能出現(xiàn)嚴重的高甘油三酯血癥（HTG）和甘油三酯（TG）誘發(fā)的胰腺炎風險升高。Waylivra能阻止載脂蛋白 C-III 的生產(chǎn)，可以減緩脂肪的分解，降低血液中甘油三酯的水平，從而減少了體內脂肪的積累，從而降低患胰腺炎的風險。

       2019年12月12日，Vyondys 53（Golodirsen）經(jīng)美國FDA加速獲批上市，用于治療確診為發(fā)生53外顯子跳躍基因突變的杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）的患者。

       2020年8月12日，F(xiàn)DA批準將Viltepso（viltolarsen）注射劑用于可治療的杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）患者外顯子53跳過治療。由于肌營養(yǎng)不良蛋白的缺乏是DMD的根本原因，因此盡可能早地增加肌營養(yǎng)不良蛋白是DMD治療的關鍵目標。Viltepso是第一個也是唯一的第53外顯子跳過療法，證明四歲以下兒童的肌營養(yǎng)不良蛋白增加。

       2021年02月25日，Amondys 45（casimersen）獲批上市，用于治療外顯子45跳躍基因突變的杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）患者。Amondys 45成為繼Exondys 51 (eteplirsen)和Vyondys 53(golodirsen)之后，第3個在美國獲批的RNA外顯子跳躍突變DMD的反義寡核苷酸療法。

       2、siRNA 類藥物

       siRNA 是RNA干擾機制的典型代表，可以實現(xiàn)靶蛋白的高效沉默。siRNA為雙鏈 RNA， 由正義和反義鏈組成。siRNA 的作用位點為細胞漿。細胞漿中的siRNA 可以與 RNA 介導的沉默復合體 (RISC) 復合。復合后siRNA發(fā)生雙鏈解聚，其中正義鏈離開 RISC 復合體， 反義鏈繼續(xù)與RISC復合。反義鏈含有與靶標mRNA互補配對的堿基序列，因此能夠引導 RISC復合物與靶標mRNA 結合。RISC 復合物中含有核酸降解酶 argonaute， 當siRNA 反義鏈結合mRNA 后，RISC中的argonaute 酶就會降解mRNA，從而減少mRNA對相應蛋白的翻譯。siRNA 對于由基因異常表達或基因突變引起的疾病，如癌癥、病毒感染和遺傳疾病等的治療具有巨大的應用潛力。并且由于其 RNA干擾過程發(fā)生在細胞質中，不需要穿透細胞核，這使siRNA 核酸藥物的開發(fā)更具吸引力。

       目前被 FDA 批準上市的siRNA藥物有5款。2018年8月11日，首例siRNA 藥物Onpattro（patisiran）通過 FDA 審批并正式上市，用于治療遺傳性甲狀腺素介導的淀粉樣變性的多發(fā)性神經(jīng)病。是首 款siRNA藥物及首 個非病毒給藥系統(tǒng)（LNP遞送系統(tǒng)）的基因治療藥物。適應癥為遺傳性轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（hATTR）引起的周圍多發(fā)性神經(jīng)疾病，機制為沉默hATTR mRNA的表達，減少產(chǎn)生hTTR蛋白，逐漸減少周圍神經(jīng)中淀粉樣沉積物（hTTR）的積累，最終達到治療疾病的目的。臨床給藥途徑為靜脈輸注，每3周1次。siRNA分子的分子量約為14kD，具有生物大分子結構特性。

       2019年，Alnylam公司的RNAi療法Givlaari（givosiran）獲批上市，成為繼Onpattro（patisiran）之后的第二款上市的RNAi新藥，用于治療成人急性肝卟啉癥（AHP）患者。Givlaari是一款皮下注射的RNAi藥物，它能夠靶向降解編碼ALAS1蛋白的mRNA。ALAS1是合成ALA和PBG的重要蛋白酶，每月接受Givlaari^®治療能夠顯著持久地降低肝臟中ALAS1的水平，從而將具有神經(jīng)毒性的ALA和PBG的水平降低到正常范圍。

       2020年11月23日，F(xiàn)DA批準Alnylam制藥公司的RNAi療法Oxlumo（Lumasiran）作為首 個治療原發(fā)性高草酸尿1型（PH1）的藥物，PH1是一種罕見的遺傳性疾病。Oxlumo獲得孤兒藥稱號和突破性治療指定。Oxlumo是第一個被批準用于治療PH1的藥物，也是唯一一個被證明可以降低有害草酸水平的療法。3期臨床數(shù)據(jù)顯示，Oxlumo治療能顯著減少肝臟中草酸的生成，這可能解決PH1的內在病理生理學問題。

       2020年12月11日，Novartis Pharma GmbH諾華制藥公司宣布歐盟已經(jīng)正式批準該公司的Leqvio（inclisiran），作為飲食控制的一種輔助手段，用于治療成人原發(fā)性高膽固醇血癥（雜合子家族性和非家族性）或混合型血脂異常，Leqvio^®成為了全球第一個也是唯一一個小干擾RNA（siRNA）降膽固醇（LDL-C）療法，是一款全球首批的"first-in-class"的治療藥物，具有里程碑意義。

       2022年6月14日， FDA批準Amvuttra（vutrisiran）用于治療成人遺傳性轉甲狀腺素介導（hATTR）淀粉樣變性的多發(fā)性神經(jīng)病。hATTR淀粉樣變性是一種罕見的、遺傳性的、進展迅速的致命疾病，有多發(fā)性神經(jīng)病表現(xiàn)，治療方法很少。

       3、mRNA 類藥物

       mRNA類藥物由成百上千個核苷酸組成，可以上調體內靶蛋白的表達。mRNA 在細胞漿中發(fā)揮作用，作用機制為與核糖體結合進行靶蛋白翻譯。mRNA 翻譯的靶蛋白可以是細胞內蛋白，也可以被細胞分泌出去，從而被其他細胞攝取 (如抗原遞呈細胞)，或與細胞表面的靶點發(fā)生特異性相互作用。mRNA體內外穩(wěn)定性較差，但是mRNA 藥物不需要細胞核定位，從而避免了基因組整合導致的突變，因此，這些藥物被認為是高度安全的。

       mRNA核酸疫苗在新冠病毒防疫中的應用是mRNA 技術的典型代表。Moderna公司的新冠疫苗Spikevax和Pfizer-BioNTech公司的新冠疫苗Comiranty都屬于mRNA類核酸藥物。這兩款疫苗的二價加強版已經(jīng)獲得了美國 FDA 批準并上市。上述疫苗所含的mRNA 均編碼新冠病毒表面刺突蛋白，而且通過 S-2P 技術對所表達的抗原蛋白進行了融合前構象限定，以便于呈現(xiàn)病毒表面刺突蛋白的原生態(tài)抗原表位。上述兩款 mRNA新冠疫苗的首次獲批，揭開了mRNA技術藥物在現(xiàn)實世界中應用的序幕，具有里程碑意義。兩款 mRNA 新冠疫苗成功的關鍵在于：其不但可以誘發(fā)機體產(chǎn)生針對新冠病毒刺突蛋白的中和抗體，還能產(chǎn)生強大的抗原特異性細胞免疫。細胞免疫尤其是CD8+ T細胞免疫響應的產(chǎn)生依賴于脂質納米粒（LNP）介導的核酸溶酶體逃逸。mRNA在LNP 的輔助下，經(jīng)溶酶體逃逸進入免疫細胞胞漿后，可以利用胞漿內核糖體表達刺突蛋白。表達的刺突蛋白隨后被胞漿內的蛋白酶體降解成片段。在胞漿中，上述抗原片段可被MHC I 分子識別，并遞呈給 T 細胞，從而促進細胞免疫偏向型 T 輔助細胞的分化，并最終誘導 CD8+ T 細胞的成熟。另一方面，mRNA 所表達的刺突蛋白可以被分泌到細胞外，并被周邊其他免疫細胞攝取，并經(jīng)由包涵體-溶酶體路徑實現(xiàn) MHC II 分子抗原遞呈，從而誘發(fā)產(chǎn)生后續(xù)以 B 細胞為主的體液免疫。體液免疫和細胞免疫在預防病毒感染致病方面同等重要。體液免疫中B細胞產(chǎn)生的中和抗體可與進入機體的游離病毒刺突蛋白發(fā)生特異性結合，通過病毒顆粒包裹和免疫細胞吞噬將其清除。而細胞免疫中的 CD8+ T細胞可以識別已經(jīng)被新冠病毒感染的機體細胞，通過釋放顆粒酶和穿孔素等策略殺傷清除被感染的機體細胞。上述兩種機制，尤其是 mRNA-LNP 新冠疫苗通過包涵體-溶酶體逃逸誘發(fā)產(chǎn)生的較強細胞免疫，使其在抵御新冠病毒感染方面展現(xiàn)出明顯優(yōu)于其他疫苗的優(yōu)勢。

       4、核酸適配體

       核酸適配體為長度50～120個堿基的單鏈核酸。核酸適配體包括DNA適配體和RNA適配體。盡管與其他核酸同樣由DNA 或 RNA 組成，但是適配體的作用靶點既不在pre-mRNA 上，也不在mRNA 上，而是直接作用于靶蛋白，并通過空間位阻阻斷蛋白行使相應功能。與抗體相比，核酸適配體具有合成簡單、成本較低和作用靶標廣泛等特點，在疾病診斷、治療和預防中有著更廣泛的藥物應用潛力。目前，疾病治療中應用最成功的核酸適配體藥物是pegaptanib sodium。pegaptanib sodium商品名為Macugen，用于治療年齡相關性黃斑變性(AMD)，AMD是發(fā)達國家的主要致盲眼病之一。AMD 與內皮生長因子(VEGF) 的異常增加有關，VEGF165是VEGF的主要異構形式，也是該病最重要的治療靶點。pegaptanib sodium能靶向性抑制VEGF165 活性，可特異性結合VEGF165 的肝素結合區(qū)，使VEGF165不能再與VEGF受體結合，從而使VEGF165 無法產(chǎn)生活性而產(chǎn)生藥效，目前該藥物已經(jīng)退市。

       參考資料

       [1]崔麗莉,張勇.上市核酸藥物及其脂質納米遞送載體研究進展[J].藥學學報,2023,58(04)

       [2]王均,王蘭,呂家臻等.上市核酸藥物的療效分析和研究進展[J].中國新藥雜志,2019,28(18)

       [3]董志輝,許小丁.核酸藥物研究進展及挑戰(zhàn)[J].實用醫(yī)學雜志,2022,38(11)

       作者簡介：小米蟲，藥品質量研究工作者，長期致力于藥品質量研究及藥品分析方法驗證工作，現(xiàn)就職于國內某大型藥物研發(fā)公司，從事藥品檢驗分析及分析方法驗證。