微生物發(fā)酵項(xiàng)目放大需經(jīng)過小試、中試到大生產(chǎn)的過程。其中搖瓶前規(guī)模為小試，以發(fā)酵罐到更大規(guī)模發(fā)酵罐為中試。中試放大一是可以探索實(shí)驗(yàn)室的新菌種的生產(chǎn)效能，探索之前確定的發(fā)酵環(huán)境的適配性與在優(yōu)化，包括發(fā)酵培養(yǎng)基配方和工藝條件；中試放大二是可以對生產(chǎn)上發(fā)現(xiàn)的問題進(jìn)行小規(guī)模再研究，可降低糾錯(cuò)成本，中試放大是小試實(shí)驗(yàn)研究到工業(yè)化生產(chǎn)的過渡，也是微生物發(fā)酵項(xiàng)目成功的必需，而其中上發(fā)酵罐又是這過程的關(guān)鍵一步，因?yàn)閺膿u瓶到發(fā)酵不僅僅是量的變化，更是增加反饋與控制的第一次質(zhì)變。
曾經(jīng)有人包括合成生物學(xué)的博士咨詢筆者，小試發(fā)酵如何設(shè)置發(fā)酵罐并開始發(fā)酵呢？個(gè)人回答一般的方法論是，參照搖瓶或者一般知識(shí)確定起始參數(shù)開啟發(fā)酵，再結(jié)合罐上的具體情況科學(xué)調(diào)整逐步優(yōu)化。
第一步，通過說明書或者與廠家工程師交流熟悉發(fā)酵罐。國內(nèi)的品牌有國強(qiáng)、百侖、保興等的，其硬件與軟件都不一樣，僅僅是使用的話熟悉起來也很容易。按照攪拌系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)、補(bǔ)料系統(tǒng)與供排氣系統(tǒng)等幾個(gè)系統(tǒng)去了解，pH、溶解氧等電極按照說明書標(biāo)定，補(bǔ)料的泵速按照說明書用天平與水來標(biāo)定。需要注意的是，小型發(fā)酵罐啟用前可能是直接放入滅菌鍋里滅菌的，所以滅菌時(shí)需要斷開一切的反饋與控制的連接，而在滅菌完成后開始發(fā)酵前又要及時(shí)與控制柜做好各系統(tǒng)的連接。
第二步，通過搖瓶或者一般知識(shí)確定起始參數(shù)。
① 我們把發(fā)酵罐的基礎(chǔ)料體積除以發(fā)酵罐的總體積的得數(shù)叫裝料系數(shù)，這個(gè)系數(shù)因攪拌大小、泡沫大小及罐本身的設(shè)計(jì)與大小而有所不同，一般地剛開始上罐時(shí)可以定在40-60%，比如5L的罐基礎(chǔ)料可以是2L到3L；
② 先可以直接采用搖瓶發(fā)酵時(shí)的培養(yǎng)基配方，或者通用的網(wǎng)絡(luò)可查的各類菌對應(yīng)的通用配方。按照罐的控制系統(tǒng)補(bǔ)料泵個(gè)數(shù)，考慮幾路控制補(bǔ)料。消泡劑控制發(fā)酵過程中可能的起泡，這個(gè)的反饋與控制可利用罐上的泡沫感應(yīng)器自動(dòng)控制；酵母控制pH可采用液堿，大腸桿菌控制pH可采用氨水，這個(gè)的反饋與控制可利用罐上的pH計(jì)自動(dòng)控制；補(bǔ)充氮源來生產(chǎn)蛋白或者補(bǔ)充碳源來生產(chǎn)其他產(chǎn)物，這個(gè)也可自動(dòng)控制，只是因牽涉到整個(gè)工藝調(diào)整，后續(xù)再展開；
③ 我們把多少通風(fēng)量L/min除以料液體積L的得數(shù)叫vvm，這個(gè)系數(shù)因菌種對氧的需要及罐本身的設(shè)計(jì)而有所不同，小罐試驗(yàn)時(shí)可初定比較高一點(diǎn)的，比如酵母1，大腸桿菌1.5，再按照基礎(chǔ)料體積計(jì)算后先不變動(dòng)；
④ 攪拌轉(zhuǎn)速，一般建議根據(jù)搖瓶而來起始設(shè)定為200rpm，隨著菌體的生長，之后設(shè)定溶解氧在30%左右時(shí)關(guān)聯(lián)攪拌提速，也可手動(dòng)逐步提速。酵母8h前延滯期內(nèi)，大腸桿菌4h前的延滯期內(nèi)溶氧下降緩慢而攪拌轉(zhuǎn)速可不提升，經(jīng)過對數(shù)生長期時(shí)是攪拌逐步提升的過程，酵母16h左右到400rpm，大腸桿菌8h左右到600rpm。
第三步，結(jié)合罐上的具體情況科學(xué)調(diào)整逐步優(yōu)化。即使前幾批主要是與設(shè)備磨合的一些調(diào)整，其實(shí)發(fā)酵已經(jīng)開始，而你也開始涉及到發(fā)酵工藝調(diào)整了。
① 如果延滯期過長，或者平臺(tái)期的OD600較低?？蓮奶嵘臃N量、優(yōu)化培養(yǎng)基碳氮比，增加微量元素等措施試試改善。
② 如果補(bǔ)料過多，或者發(fā)酵罐體積過大?？蓮南抡{(diào)基礎(chǔ)料體積，降低補(bǔ)料速度或者提升補(bǔ)料濃度等措施試試改善。
因?yàn)榘l(fā)酵罐補(bǔ)料使?fàn)I養(yǎng)比搖瓶豐富，高轉(zhuǎn)速下傳質(zhì)傳熱比搖瓶好，其控制的維度也比搖瓶多，量變到質(zhì)變，故此認(rèn)為與搖瓶相比發(fā)酵罐是一次質(zhì)的飛躍，發(fā)酵罐有比搖瓶復(fù)雜得多的內(nèi)容。
真正要做到持續(xù)穩(wěn)定發(fā)酵，需要有微生物知識(shí)與無菌操作作為前提，有對物料、設(shè)備、自動(dòng)化控制的理解及一定的檢測分析能力作為解決異常的保障，還要有系統(tǒng)化的分析思維，因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中各參數(shù)是相關(guān)關(guān)聯(lián)的，一個(gè)結(jié)果對應(yīng)的原因是多方面的，有時(shí)甚至是反向的，比如pH突然上升是罐壓下降或者堿液泵自控異常、發(fā)酵液染菌異常還是缺糖；比如泡沫異常時(shí)，是補(bǔ)料不夠缺營養(yǎng)，還是補(bǔ)料過多生長過快導(dǎo)致自溶等等，需要經(jīng)過多手段確認(rèn)后再去調(diào)控方可保證發(fā)酵持續(xù)穩(wěn)定，這些在后續(xù)再展開。今天你已經(jīng)開始使用發(fā)酵罐了。
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