微生物發(fā)酵是指在適宜的條件下逐級(jí)培養(yǎng)微生物，利用微生物的初級(jí)或次級(jí)代謝，經(jīng)過微生物固有的或者人為改造的代謝途徑，將廉價(jià)易得的原材料轉(zhuǎn)化為所需要的目標(biāo)產(chǎn)物的過程。
個(gè)人理解的微生物發(fā)酵工藝包括三部分，菌種的選育與活化、種子放大及發(fā)酵的控制參數(shù)、發(fā)酵液中目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化工藝。
第一部分是優(yōu)良菌株的選育，一般包括底盤菌株的篩選；基因工程路線設(shè)計(jì)與菌株改造；新菌株的馴化與篩選，這很多是前期研發(fā)的工作。還包括對(duì)選定菌株好氧情況、營(yíng)養(yǎng)需求與代謝途徑的深入研究，最終落實(shí)到搖瓶條件摸索，如起始碳源、氮源，與初步培養(yǎng)基組成，并確定初步發(fā)酵條件。
第二部分是種子放大及發(fā)酵控制參數(shù)研究，摸索出最適種子培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)工藝，利用密集細(xì)胞生產(chǎn)出高濃度高含量的代謝產(chǎn)物。一般包括種子級(jí)數(shù)與放大倍數(shù)的選擇，種子及發(fā)酵周期的確定，種子及發(fā)酵培養(yǎng)基組成，種子及發(fā)酵的接種量、培養(yǎng)溫度、pH、溶氧與攪拌等參數(shù)與發(fā)酵補(bǔ)料控制；此部分開始于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，經(jīng)逐級(jí)非線性放大，摸索經(jīng)驗(yàn)后反復(fù)調(diào)整，落腳于生產(chǎn)規(guī)模得出最大產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率與生產(chǎn)強(qiáng)度的放大工藝。還包括在此過程中的雜質(zhì)對(duì)比、發(fā)酵液狀態(tài)對(duì)比，補(bǔ)料與產(chǎn)出的經(jīng)濟(jì)性對(duì)比等。由于微生物細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)及細(xì)胞間自身相互反饋調(diào)節(jié)的復(fù)雜性，在小試放大過程中會(huì)出現(xiàn)許多問題，解決這些問題是微生物發(fā)酵工藝開發(fā)的核心關(guān)鍵所在。
第三部分是發(fā)酵液中目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化工藝，一般包括制定分離路線與各模塊參數(shù)，最終得到高質(zhì)高量的目標(biāo)產(chǎn)品。還包括物料平衡的估算、熱力學(xué)估算、目標(biāo)產(chǎn)物穩(wěn)定性等。
對(duì)于菌株，不同的底盤最終落實(shí)到工藝上差距非常大，故此在改良前篩選底盤菌株很重要；另外不同的改良策略對(duì)應(yīng)不同的菌株穩(wěn)定性、耐受性。一般地，外源質(zhì)粒直接導(dǎo)入后對(duì)于菌種的穩(wěn)定傳代要求較高，發(fā)酵放大時(shí)每一步也需要考慮比生長(zhǎng)速率，具體地需盡可能地控制OD，生長(zhǎng)過慢不利于發(fā)酵，而生長(zhǎng)過快質(zhì)粒容易丟失；自身染色體改造，適當(dāng)敲除一些基因，改變目標(biāo)產(chǎn)物前體、目標(biāo)產(chǎn)物的代謝流，菌種的穩(wěn)定性較好，但同時(shí)會(huì)可能出現(xiàn)代謝流紊亂與難于控制。穩(wěn)定性提升可能會(huì)降低轉(zhuǎn)化率指標(biāo)，合適的發(fā)酵工藝可以縮小降低量。
對(duì)于摸索發(fā)酵最適條件，包括最適菌體生長(zhǎng)溫度與最適生產(chǎn)溫度，摸索最適生長(zhǎng)pH與最適生產(chǎn)pH，最適生長(zhǎng)好氧與最適生產(chǎn)好氧控制，不同的菌種不同，同一底盤經(jīng)不同的改造策略得到的菌種也不同。如一般大腸桿菌的誘導(dǎo)生產(chǎn)溫度可比最適生長(zhǎng)溫度低6℃，這樣穩(wěn)定了質(zhì)粒傳代也提升了組酶的整體效率并延長(zhǎng)了產(chǎn)物周期，另發(fā)酵后期相比于中期可略升高2℃，以提升生產(chǎn)強(qiáng)度；最適生產(chǎn)pH需結(jié)合組酶的活性及目標(biāo)產(chǎn)物積累后對(duì)于pH影響，如氨基酸發(fā)酵的種子生長(zhǎng)pH控制近中性而產(chǎn)物發(fā)酵階段略低，而萜類恰恰相反；最適生長(zhǎng)好氧狀態(tài)，不能局限于代謝理論，簡(jiǎn)單地認(rèn)為需養(yǎng)就加大氧供給，需實(shí)際摸索，有時(shí)與理論恰恰相反，這關(guān)乎菌體生產(chǎn)、底物轉(zhuǎn)化率、生產(chǎn)強(qiáng)度與雜質(zhì)生成。有些發(fā)酵工藝是固定通風(fēng)，根據(jù)溶氧反饋聯(lián)動(dòng)轉(zhuǎn)速控制；有些發(fā)酵工藝是根據(jù)菌絲形態(tài)增加或者降低攪拌而相應(yīng)地減少或者增加通風(fēng)，溶氧僅為參照。
對(duì)于發(fā)酵液分離純化，遵循先提取后純化的整體思路，固液分離、雜質(zhì)分離與產(chǎn)品濃縮。離心壓榨過濾或者膜過濾，兩相萃取或者樹脂柱層析，超濾納濾及沉淀結(jié)晶、冷凍干燥等不同模塊的不同組合?，F(xiàn)在微生物下游的效率及產(chǎn)品質(zhì)量也是評(píng)價(jià)整個(gè)工藝開發(fā)的一個(gè)首要指標(biāo)，如在雜質(zhì)方面，要求在菌株設(shè)計(jì)階段就需要考慮類似物質(zhì)的含量，選擇類似產(chǎn)物積累較少的菌株；要求在發(fā)酵工藝放大時(shí)，需要考慮有否能減少類似產(chǎn)物積累的工藝條件，并盡可能避免增加雷士產(chǎn)物積累的環(huán)境，或者平衡各參數(shù)使某項(xiàng)或者總體某類雜質(zhì)減少。
微生物發(fā)酵工藝小試放大，以發(fā)酵放大為承前啟后的關(guān)鍵，以解決各級(jí)放大問題為工藝完善提升的首要抓手，可以多做些前瞻后延的嘗試。如培養(yǎng)基優(yōu)化時(shí)，雖然提倡種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基接近，以使微生物快速適應(yīng)新環(huán)境，但是這樣的種子培養(yǎng)基不一定是最佳；原理上消耗TPP較多的路線在發(fā)酵不同階段不一定都是高溶氧好，更不一定是高轉(zhuǎn)速好；樣品處理時(shí)摸索酸堿及溫度對(duì)產(chǎn)品的影響，同一樣品開發(fā)氣相、液相雙方法及多方法對(duì)比；關(guān)注后期發(fā)酵液狀態(tài)、產(chǎn)物峰譜圖，指導(dǎo)發(fā)酵下游技術(shù)等等。
實(shí)際上微生物發(fā)酵工藝小試放大的三部分也不是物理分割的，發(fā)酵放大時(shí)可根據(jù)轉(zhuǎn)化及生產(chǎn)強(qiáng)度情況，根據(jù)產(chǎn)物雜質(zhì)情況，對(duì)菌株提出進(jìn)一步改良的可能與必要；發(fā)酵放大時(shí)可分析不同工藝、周期的發(fā)酵液狀態(tài)，選擇合適的控制方法，甚至可為后續(xù)的分離純化簡(jiǎn)化路線提供可能。
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