金筆獎 | 抗體藥物如何惠及于民？連續(xù)生產工藝或成突破口

       抗體生產成本有望降低到15美元/克以下

       21世紀被稱為生命科學和生物技術的時代，生物制藥行業(yè)在過去的20年間有了長足的發(fā)展，特別是抗體類藥物的銷售額逐年攀升。目前，大部分抗體類產品是以batch或fed-batch的模式進行細胞培養(yǎng)和表達。隨著多個重磅原研生物藥的專利到期，為了滿足臨床未及的需求和降低原研生物藥的昂貴醫(yī)療費用，越來越多的制藥企業(yè)進入生物類似藥的開發(fā)領域，這進一步加劇了生物類似藥的競爭，企業(yè)成本壓力日益凸顯，因此，越來越多的制藥企業(yè)將上、下游工藝由批次生產向連續(xù)生產轉移，以此獲得更高的抗體產量。

       圖1 抗體藥物生產工藝流程圖

       一份成本研究報告表明，單抗產品從批次轉到連續(xù)生產將會節(jié)省70%的生產成本投入。2017年11月2日，藥明生物與頗爾公司宣布在上海創(chuàng)建聯(lián)合實驗室，攜手開發(fā)完整的單克隆抗體連續(xù)生產工藝。通過此次聯(lián)合實驗室的合作，藥明生物計劃近期將該工藝放大至500升規(guī)模，抗體生產成本則降至30-50美元/克；之后將放大到多個1000升規(guī)模，抗體生產成本便有望降低到15美元/克以下。

       包括FDA、EMA和PMDA在內的法規(guī)監(jiān)管部門都支持連續(xù)流生產工藝這種生產方式的革新，接受連續(xù)流生產的藥物制品。監(jiān)管部門認為，連續(xù)流生產的好處在于更少操作步驟的集成化生產過程，需要更少的設備和設施，同時這種新興的技術適用QbD的工藝設計原則，有潛力提供更高的生產效率，有的靈活性。監(jiān)管部門對于連續(xù)生產工藝適用于現(xiàn)有的法規(guī)監(jiān)管體系達成共識，對于連續(xù)生產工藝沒有特殊的法規(guī)要求。同時，F(xiàn)DA、EMA 和PMDA等部門都有專門的新技術團隊來鼓勵和幫助新技術的實施和應用。2017年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準了幾項連續(xù)流的生產，正在積極推動醫(yī)藥行業(yè)接受這項新技術。FDA認為使用連續(xù)流生產技術可以降低生產中的人為差錯，提高藥品質量。

       越來越多的制藥公司都在嘗試連續(xù)流的生產，并且認為連續(xù)生產對生物藥品生產能帶來諸多好處：（1）從上游開始的連續(xù)性生產工藝可節(jié)省占地空間、減少固定資產投入、提高單位時間生產效率；（2）模塊化的操作集成一次性產品使得工藝靈活高效，可多地復制生產，符合不同地區(qū)的監(jiān)管標準。抗體藥物行業(yè)連續(xù)生產的新技術從上游發(fā)酵貫穿到下游純化至原液制備，現(xiàn)階段已經可以應用在藥物研發(fā)和生產的連續(xù)工藝技術主要包括連續(xù)灌流生產、連續(xù)細胞澄清、連續(xù)流層析、在線病毒滅活、在線濃縮與在線洗濾等。

       【連續(xù)灌流培養(yǎng)技術】

       連續(xù)灌流培養(yǎng)技術是指接種后新培養(yǎng)基的持續(xù)加入，含有產品的培養(yǎng)基持續(xù)收獲，細胞截留裝置將細胞保留在反應器中。相對于批次培養(yǎng)，灌流培養(yǎng)從根本上解決營養(yǎng)物耗竭和代謝副產物積累之間的矛盾，極大地提高培養(yǎng)過程中的細胞密度、延長培養(yǎng)周期，提高目的產品產量。凝血因子VIII是第一個獲得批準的采用灌注工藝生產的生物藥物，生產周期達到185天，細胞密度和凝血因子VIII產能與批式培養(yǎng)相比可提高30倍。按上述結果計算一個100-500L的反應器就可達到批式培養(yǎng)3000-15000L反應器的生產能力，大大降低了對工廠規(guī)模的要求，Clincke等在10 L的WAVE反應器中通過使用ATF截留系統(tǒng)培養(yǎng)CHO細胞，細胞密度達到了2.14×108cells/ml，經過12天的培養(yǎng)，抗體濃度達到了3g/L。

       連續(xù)灌流培養(yǎng)技術是一個復雜的體系，很多條件共同起作用，從而改善細胞培養(yǎng)效果，如合適的培養(yǎng)基、灌流策略以及截留方式等，其中生物反應器內的細胞截留方式也是一個需要考慮的重要環(huán)節(jié)。當新鮮培養(yǎng)基持續(xù)補充的同時，含有代謝產物的舊培養(yǎng)基也需要不斷地從反應器內移出，以保證培養(yǎng)體積和環(huán)境穩(wěn)定。同時，在細胞密度不斷增加時，需要相應地提高灌流速率來滿足細胞對營養(yǎng)物質的快速消耗，普通的截留裝置在高流速、粘度的料液中極易發(fā)生堵塞，造成培養(yǎng)無法正常繼續(xù)下去。目前應用較多的分離技術有Wave Lily pad截留膜技術、中空纖維（ Hollow Fiber）技術、連續(xù)流離心機技術及超聲細胞分離技術。

       圖2 連續(xù)灌流培養(yǎng)示意圖

       通過連續(xù)灌流培養(yǎng)技術延長培養(yǎng)時間，可獲得更高的細胞密度，增加蛋白表達量，同時目的產物在生物反應器更短的滯留時間有利于維持產物的質量。在實際生產應用中，灌流工藝可以減小設備的尺寸和提高單位體積的產率，可將上游生產和下游純化整合到一起，更有利于一次性技術平臺的搭建，從而降低相應的設備及廠房固定資產投入。

       【連續(xù)細胞培養(yǎng)液澄清】

       連續(xù)細胞培養(yǎng)液澄清是連續(xù)生產工藝中的關鍵步驟，目前主要的手段有連續(xù)流離心、切向流膜過濾和基于聲波原理的分離方法。

       連續(xù)流離心能夠有效的去除細胞和大細胞碎片，但是在離心過程中細胞可能會被破壞，在離心中許多亞微米大小的顆粒不能被去除，這樣就增加了后續(xù)的深度過濾的負擔。

       膜過濾技術一直被廣泛應用于固液分離，但是膜堵塞一直是這項技術中一直存在的難點。切向流膜過濾技術通過引入切向的沖刷作用，實現(xiàn)了料液的長時間循環(huán)，從而被廣泛運用于灌流工藝中。

       基于聲學分離原理，細胞培養(yǎng)液的澄清實現(xiàn)了一種全新的可放大的一次性技術，這種技術是使用低頻聲波產生一個貫穿流道的3D聲波，當細胞進入帶有串聯(lián)的帶有聲波發(fā)生器的腔室，細胞及細胞碎片被聲波作用捕獲，然后細胞遷徙到駐波節(jié)點，并開始聚集在一起，最后聚集細胞由于浮力降低，在重力作用下從懸浮液中沉降下來，設備所濾出的物料即為澄清后的細胞培養(yǎng)液。這種聲學原理澄清方式的產出物質量和離心方案相同，但解決了離心方案中占地空間需求高及清潔驗證復雜的問題。同時，從聲學分離器濾出的濁度下降的同時也減少了二級澄清所需深層濾板及后續(xù)生物負載控制過濾的過濾面積需求。

       【連續(xù)流層析技術】

       傳統(tǒng)的下游純化是以批次方式進行，產品的結合、洗脫等純化操作都是在單一層析柱中完成。填裝后的柱床為避免產品過載，層析介質的利用率僅為其靜態(tài)載量的50-70%。為適應上游表達量的提升，通常會選擇單柱多循環(huán)層析。

       應對上游灌流連續(xù)生產和批次生產日益提高的表達量，下游的純化方式也從批次向連續(xù)純化轉變。連續(xù)流層析技術是使用一系列互相連接且顯著變小的層析柱，在短的接觸時間內，以過載上樣的方式進行樣品純化的生產方式。層析柱在上樣與非上樣過程之間切換，每個上樣過程包含兩根層析柱，以保證前上樣柱在達到一定的樣品流穿水平后及上樣后沖洗過程中，流穿樣品完全被后根層析柱吸附，非上樣層析柱同時執(zhí)行洗脫、清洗、及平衡過程。上樣與非上樣步驟的同時進行可大幅縮短工藝時間，縮小設備規(guī)模并較少緩沖液用量。同時，連續(xù)層析過載上樣能提高介質的利用效率，小規(guī)模層析柱短的接觸時間能顯著提高生產效率（g/l/hr），更小的操作單元集成一次性技術使得連續(xù)層析技術有極高的靈活性，與傳統(tǒng)批處理相比，它可提高介質使用率40-60%；此外還可使產量提高2倍。另一方面，由于連續(xù)流層析技術可以更快的純化出活性大分子，該項技術也被應用于純化相對不穩(wěn)定的蛋白，例如酶類或者重組凝血因子類蛋白。連續(xù)層析技術適用于不同的分離方式，在抗體純化領域，已有供應商提供多柱位連續(xù)流層析產品，如GE ?KTA pcc75可在同一臺設備上同時進行陰、陽離子兩步層析操作，使得抗體產品下游純化實現(xiàn)全過程的連續(xù)生產。

       當然，連續(xù)流層析技術的應用還面臨工藝上的幾個難點：第一，如何自動化控制以滿足整個生產周期中不穩(wěn)定的上游料液變化；第二，如何保證層析填料能夠在整個生產周期中保持穩(wěn)定的分離效果；第三，如何有效實現(xiàn)無菌工藝。目前，生物制藥行業(yè)已有藥品生產企業(yè)應用連續(xù)層析技術生產的藥品進行臨床申報，賽諾菲也在研究該技術在**領域中的應用。

       【在線濃縮技術】

       在線濃縮技術又稱為單向切向流過濾技術，特殊設計的膜包流路使得料液單向通過膜材可濃縮4-6倍。該連續(xù)生產工藝的突出優(yōu)勢在于節(jié)省了每個單元操作間的大體積存儲容器，減少了系統(tǒng)的死體積并提高了產品的回收率，最終節(jié)省了占地空間。在線濃縮裝置在連續(xù)生產過程中可用于細胞液澄清后的濃縮，減少層析上樣量，提高連續(xù)流層析單位時間產率，較批次生產效率提高5倍以上。在線濃縮裝置在連續(xù)生產過程中還可用于最后原液產品的制備，2套在線濃縮裝置串聯(lián)使用，可達到40倍的連續(xù)濃縮效果。

       連續(xù)生產技術有多種實現(xiàn)方式，主要分為：（1）上游到下游的全連續(xù)生產模式，每一個單元間藥液持續(xù)運行；（2）端到端的連續(xù)生產模式，進料和出料是連續(xù)生產，中間操作單元可以是批次方式。（3）雜合的連續(xù)生產模式，部分生產工藝為連續(xù)，其他部分為批次形式。目前，全連續(xù)生產所需的在線稀釋、在線病毒滅活、在線洗濾等技術也在持續(xù)研發(fā)中，相信不久的將來將會實現(xiàn)完整的抗體藥物全連續(xù)生產。

       作者簡介：張功臣，制藥行業(yè)專家，主要從事制藥用水系統(tǒng)、無菌與生物工藝系統(tǒng)的研究與實踐。全國大學生制藥工程設計競賽委員會專家，國際制藥工程協(xié)會（ISPE）培訓專家，國家藥品監(jiān)督管理局檢查員培訓專家，中國藥典通則0261制藥用水課題組專家，國家標準《GB50913-2013 醫(yī)藥工藝用水系統(tǒng)設計規(guī)范》編委。