間充質(zhì)干細(xì)胞抑制瘢痕作用機(jī)制以及提高皮膚修復(fù)效率的方法

       皮膚是機(jī)體最大的器官，具有屏障、吸收、感覺(jué)、體溫調(diào)節(jié)、代謝、免疫等多種生理功能。大面積皮膚燒傷、皮膚良惡性腫瘤、皮膚色素性疾病等引起的皮膚損傷嚴(yán)重影響患者健康。其中，皮膚燒傷不僅破壞皮膚的屏障功能，還改變皮膚的痛覺(jué)、溫覺(jué)、觸覺(jué)等。研制含皮膚附屬器的功能性組織工程全層皮膚是解決大面積皮損的有效途徑，具有重要的研究?jī)r(jià)值。近年來(lái)，隨著組織工程學(xué)的飛速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是構(gòu)建全層皮膚的理想種子細(xì)胞，在治療皮膚創(chuàng)傷方面展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。

       1、皮膚愈合的過(guò)程和機(jī)制

       皮膚損傷修復(fù)需要經(jīng)過(guò)皮膚細(xì)胞嚴(yán)密的編排、整合及分化、遷移、增殖和凋亡過(guò)程，才能實(shí)現(xiàn)皮膚多層結(jié)構(gòu)的再生。皮膚損傷的修復(fù)可以概括為以下 4 個(gè)時(shí)期：①血液凝固期：損傷初期血小板和凝血因子被激活，啟動(dòng)內(nèi)、外源性凝血途徑實(shí)現(xiàn)凝血；②炎癥反應(yīng)期：中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增多，通過(guò)吞噬異物和調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放調(diào)控炎癥反應(yīng)；③細(xì)胞增殖期：包括通過(guò)成纖維細(xì)胞增殖介導(dǎo)肉芽組織形成、通過(guò)角質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)再上皮化和通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞增殖介導(dǎo)血管生成等過(guò)程；④組織重塑期：隨著細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的分泌和肉芽組織的增生，成纖維細(xì)胞分裂合成大量膠原纖維，新生血管增多。后期在基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）作用下，降解 ECM，膠原蛋白發(fā)生新陳代謝，最終導(dǎo)致瘢痕的形成。

       2、MSCs促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、抑制瘢痕形成機(jī)制

       ①免疫調(diào)節(jié)作用。在組織損傷發(fā)生后，傷口處炎癥環(huán)境會(huì)直接刺激MSCs發(fā)揮其特有的免疫調(diào)節(jié)作用，包括增強(qiáng)環(huán)氧合酶2的活性，上調(diào)前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等。在PGE2的影響作用下，T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞開(kāi)始重新編程并開(kāi)始表達(dá)高濃度的IL-10，而研究發(fā)現(xiàn)IL-10 對(duì)無(wú)瘢痕修復(fù)必不可少，其過(guò)量表達(dá)能明顯抑制瘢痕的形成。MSCs 抑制中性粒細(xì)胞侵入到傷口處，以防止嗜中性粒細(xì)胞釋放的活性氧（reactive oxygen species，ROS），進(jìn)一步引起機(jī)體組織氧化損傷；IL-10 也可通過(guò)直接下調(diào)巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞中TGF-β1 的表達(dá)、重新編碼成纖維細(xì)胞、上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的表達(dá)、下調(diào)膠原的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的重塑以達(dá)到抗纖維化的目的。此外，IL-10 還能通過(guò)減少促炎因子IL-6 及IL-8 的表達(dá)來(lái)達(dá)到抑制膠原過(guò)度沉積。

       ②分泌一氧化氮中和活性氧。MSCs 可以促進(jìn)氧化氮合酶的產(chǎn)生，通過(guò)改變 ROS/RNS 的平衡來(lái)有效地抑制纖維化組織的形成。在創(chuàng)傷開(kāi)始的炎癥期，中性粒細(xì)胞分泌膠原過(guò)度沉積的增強(qiáng)劑如超氧化物、過(guò)氧化氫以及烷基過(guò)氧化物等大量的ROS。ROS的主要作用是對(duì)膜磷脂產(chǎn)生氧化作用以及通過(guò)對(duì)TGF-β1的誘導(dǎo)而促進(jìn)纖維化的發(fā)生。MSCs可促使ROS 轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘肿樱╮eactive nitrogen species，RNS），如過(guò)氧硝酸鹽等，減緩對(duì)DNA和膜磷脂的損傷，從而抑制纖維化的發(fā)生。

       ③分泌具有抗纖維化生長(zhǎng)因子。研究表明，MSCs可分泌各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，一些因子具有抗纖維化的作用，如肝細(xì)胞 生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）、IL-10 以及腎上腺髓質(zhì)素等。HGF 在減輕纖維化以及抑制皮膚瘢痕形成的機(jī)制主要包括：一是對(duì)成纖維細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，在HGF的存在情況下，HGF 受體通過(guò)綁定中和TGF-β/Smad 信號(hào)通路的下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制SMAD3 蛋白的促炎基因的轉(zhuǎn)錄因子作用，成纖維細(xì)胞下調(diào) TGF-β1、Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達(dá)，還可以刺激成纖維細(xì)胞 MMP 家族 MMP-1、MMP-3及MMP-13 表達(dá)的上調(diào)，促使ECM發(fā)生逆轉(zhuǎn)。二是HGF通過(guò)促進(jìn)角化細(xì)胞的遷移增殖，并上調(diào)血管內(nèi)皮 生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）的表達(dá)，促使創(chuàng)傷處生成高質(zhì)量的并且血運(yùn)豐富的肉芽組織，促進(jìn)傷口的上皮化的形成。三是HGF可抑制各種來(lái)源的肌成纖維細(xì)胞的分化，HGF可以抑制創(chuàng)傷處的成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化。

       ④調(diào)節(jié)皮膚成纖維細(xì)胞的數(shù)量及功能。MSCs可作用于損傷處的成纖維細(xì)胞來(lái)調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，使損傷皮膚的修復(fù)更接近于正常皮膚。在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中，皮膚恢復(fù)其完整性必須要有成纖維細(xì)胞的參與，但是這些成纖維細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的 ECM，從而導(dǎo)致瘢痕的產(chǎn)生。在創(chuàng)傷處的MSCs 通過(guò)分泌的生物活性分子包括HGF、PGE2 等可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞 EMT，也可以抑制肌成纖維細(xì)胞的分化。另外，在修復(fù)過(guò)程中，MSCs 還可通過(guò)旁分泌分泌生物活性因子促進(jìn)成纖維細(xì)胞的功能。

       ⑤促進(jìn)組織的血管再生及血管穩(wěn)定。創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中的炎癥階段、上皮形成期、成熟期等都必須依靠新生的毛細(xì)血管和結(jié)締組織即肉芽組織的增殖和修補(bǔ)來(lái)完成，在增殖階段，血管再生可為肉芽組織形成提供營(yíng)養(yǎng)。在血管系統(tǒng)重塑的過(guò)程中，除巨噬細(xì)胞及成纖維細(xì)胞外，MSCs也會(huì)分泌促進(jìn)血管化的細(xì)胞因子包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、VEGF-A等，促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移以及分化。另外，MSCs 還可通過(guò)旁分泌（如分泌腎上腺髓質(zhì)素等）來(lái)促進(jìn)血管的穩(wěn)定保護(hù)脈管系統(tǒng)。

       ⑥可分化為各種皮膚細(xì)胞。MSCs都具有典型的成骨、成脂及成軟骨的分化能力，這也類似于在創(chuàng)傷部位各種來(lái)源的成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化一樣，是一個(gè)表型的轉(zhuǎn)化。研究表明，MSCs 可分化為各種皮膚細(xì)胞，包括表皮細(xì)胞、角化細(xì)胞、小血管內(nèi)皮細(xì)胞等，直接參與到表皮和真皮結(jié)構(gòu)再生過(guò)程，達(dá)到促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合的目的。

       3、提高M(jìn)SCs修復(fù)皮膚損傷效率的有效途徑

       目前應(yīng)用MSCs促進(jìn)皮膚損傷修復(fù)的方法主要是局部注射和靜脈注射。局部注射一般是將MSCs注射至創(chuàng)面的周圍，但由于注射的面積和深度難以控制，并不能讓MSCs直接、均勻地分布在創(chuàng)面上。靜脈注射則不能保證所有MSCs都參與皮膚修復(fù)，且MSCs分泌的外泌體在體內(nèi)很快會(huì)被清除，難以維持較高濃度狀態(tài)，需多次給藥。此外，注射的方法還會(huì)對(duì)皮膚造成二次傷害，給治療帶來(lái)一定的困難。這些問(wèn)題使得間充質(zhì)干細(xì)胞的最終治療潛力受到限制，達(dá)不到其應(yīng)有的修復(fù)效果。因此，人們也對(duì)如何提高 MSCs 的修復(fù)效率做了許多探索，取得了較為豐富的研究進(jìn)展。

       ①生物支架。生物支架具有良好的生物相容性和生物降解性，可將干細(xì)胞輸送到傷口處。常見(jiàn)的用于促進(jìn)皮膚損傷修復(fù)藥物遞送的生物支架材料分為天然支架和合成支架。天然支架的材料成分包括透明質(zhì)酸、殼聚糖、膠原蛋白、海藻酸鹽等，合成支架材料成分包括聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸等。目前，對(duì)于皮膚損傷應(yīng)用最多的支架形式為水凝膠支架，它可以使外泌體在皮膚局部應(yīng)用后濃度更加穩(wěn)定，以延遲外泌體的釋放并增強(qiáng)其傷口愈合能力。水凝膠是一種穩(wěn)定的親水性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，通過(guò)物理、化學(xué)和生物酶法交聯(lián)而成，具有良好的生物相容性、可降解性和保水性等，已被證實(shí)是最友好、經(jīng)濟(jì)并容易獲得的材料，在臨床醫(yī)學(xué)中顯現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力。水凝膠負(fù)載間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體（MSC-EXOs）既可解決靜脈注射法造成的外泌體在體內(nèi)被快速清除的問(wèn)題，又可以將含有外泌體的水凝膠直接放置于目標(biāo)部位或其附近，能夠保證外泌體的作用劑量更加集中，同時(shí)發(fā)揮外泌體和水凝膠促進(jìn)傷口修復(fù)的作用。

       ②預(yù)處理。通過(guò)某些預(yù)處理可以改善 MSCs 的生化和生物物理特性，從而增強(qiáng)其修復(fù)功能。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基預(yù)處理的脂肪MSCs 在體外和糖尿病小鼠創(chuàng)傷模型中均顯示出血管生成能力、增殖能力和向內(nèi)皮分化能力的增強(qiáng)。MSCs 還可以經(jīng)過(guò)一些化學(xué)物質(zhì)的預(yù)處理提高修復(fù)皮膚損傷的能力。如使用卵磷脂乳化的鴯鹋油和丁基羥基甲苯處理脂肪 MSCs，顯著提高了其再生潛力。此外，也有人嘗試用生物玻璃材料激活尿液來(lái)源的MSCs，通過(guò)刺激 MSCs 與受體細(xì)胞之間以及成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的旁分泌效應(yīng)來(lái)提高小鼠皮膚的愈合能力。

       ③低氧環(huán)境。研究表明，缺氧可以提高 MSCs 的皮膚創(chuàng)傷愈合能力。在小鼠傷口愈合模型中植入人羊膜MSCs，發(fā)現(xiàn)與正常條件下培養(yǎng)的 MSCs 相比，缺氧條件下培養(yǎng)的 MSCs 具有更高的生存能力和增殖能力，并增加了血管內(nèi)皮 生長(zhǎng)因子的表達(dá)。這些MSCs 還提高了人真皮成纖維細(xì)胞的活力和遷移率，增加了細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，加速了傷口愈合。此外有研究人員發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下，小鼠的骨髓 MSCs在體外分泌了更多的堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮 生長(zhǎng)因子 A 和白細(xì)胞介素-6。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)移植的骨髓 MSCs 在低氧環(huán)境下能使皮膚傷口收縮明顯加快，體內(nèi)細(xì)胞增殖、新生血管形成速度明顯提升。

       ④基因重組。對(duì) MSCs 進(jìn)行基因重組，將 MSCs 既用作種子細(xì)胞又用作將目的基因傳遞到傷口部位的載體，也是一種很有前景的治療皮膚損傷的手段。有研究針對(duì) MSCs 進(jìn)行基因改造，通過(guò)改變其活性來(lái)增強(qiáng)其修復(fù)皮膚損傷的能力。例如，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3的骨髓 MSCs 不僅改善了家兔耳部傷口愈合過(guò)程，而且減少了瘢痕組織的形成。研究人員使用重組慢病毒載體修飾人羊膜 MSCs 過(guò)表達(dá)白細(xì)胞介素-10，發(fā)現(xiàn)其在加速小鼠傷口愈合、促進(jìn)血管生成、調(diào)節(jié)炎癥、調(diào)節(jié) ECM 重構(gòu)、促進(jìn)創(chuàng)面愈合和提高愈合質(zhì)量方面等方面明顯強(qiáng)于未修飾的 MSCs。

       ⑤細(xì)胞膜片技術(shù)。細(xì)胞膜片是一種無(wú)支架的細(xì)胞密集組織。由于細(xì)胞密度是提高細(xì)胞移植治療效果的重要因素之一，與單細(xì)胞片相比，移植構(gòu)建的分層細(xì)胞片可以更好地促進(jìn)組織功能的恢復(fù)和組織再生。研究報(bào)道，以血卟啉包合聚酮膜為材料，將骨髓MSCs 接種到膜上后敷在小鼠傷口上，這種三層細(xì)胞片移植和堆疊的方法促進(jìn)了小鼠創(chuàng)面血管生成和皮膚再生，增強(qiáng)了受損皮膚組織的修復(fù)。

       盡管 MSCs 的應(yīng)用無(wú)法復(fù)制胚胎式的創(chuàng)傷修復(fù)，而使成人的創(chuàng)傷修復(fù)達(dá)到無(wú)瘢痕的完 美修復(fù)，但它仍然可存在巨大的治療潛能。在皮膚創(chuàng)面修復(fù)愈合過(guò)程中，通過(guò)抑制皮膚瘢痕的形成達(dá)到提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量已成為當(dāng)前皮膚再生修復(fù)研究的新目標(biāo)，此時(shí)，MSCs 巨大的治療潛能則成為抑制皮膚瘢痕形成的新策略，為創(chuàng)面修復(fù)提供一種新的視角和治療手段。

       參考資料

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       作者簡(jiǎn)介：小泥沙，食品科技工作者，食品科學(xué)碩士，現(xiàn)就職于國(guó)內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事?tīng)I(yíng)養(yǎng)食品的開(kāi)發(fā)與研究。