金筆獎(jiǎng)|外泌體在藥物遞送中的研究應(yīng)用進(jìn)展

       外泌體是由多種類型細(xì)胞在正?；虿±頎顟B(tài)下分泌的特異性膜囊泡，在細(xì)胞間的信息通信和交流中發(fā)揮著十分重要的作用。外泌體廣泛存在于血液、尿液、唾液和乳汁等多種體液中，具有生物相容性好、可生物降解、無毒、免疫原性低、裝載能力強(qiáng)、能夠穿越生物屏障等優(yōu)勢，從而作為一種極有價(jià)值的天然藥物遞送載體逐漸得到了廣泛的研究與應(yīng)用。

       外泌體在藥物遞送中的優(yōu)勢

       外泌體作為具有納米級(jí)別的天然外囊泡，與其他傳統(tǒng)的藥物遞送系統(tǒng)相比具有顯著地優(yōu)勢。①與細(xì)胞療法相比，外泌體更易儲(chǔ)存且安全性較高。如外泌體遞送基因藥物不會(huì)在體內(nèi)不同部位沉積導(dǎo)致免疫排斥。此外，外泌體還可以從患者體液中分離，經(jīng)修飾后移回同一患者，大大降低了臨床中出現(xiàn)免疫反應(yīng)的可能性。②外泌體遞送藥物可以提高藥物的穩(wěn)定性。如外泌體可以保護(hù)核酸在運(yùn)輸過程中不被核酶水解。同時(shí)，外泌體可直接進(jìn)入細(xì)胞液，避免代謝消除，從而延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。③外泌體為納米級(jí)分子，且攜帶細(xì)胞表面物質(zhì)，因此具有較強(qiáng)的穿透各種生物屏障的能力。④外泌體具有基于供體細(xì)胞的天然靶向能力。如腫瘤細(xì)胞來源的外泌體攜帶腫瘤特異性抗原、蛋白質(zhì)和 RNA等物質(zhì)，可以起到抗腫瘤免疫的作用。

       外泌體載藥方式

       外泌體的天然屬性使其成為非常有潛力的藥物遞送載體，可用于遞送各種化學(xué)物質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等。目前，將藥物載入外泌體的方法可分為內(nèi)源性載藥和外源性載藥。

       內(nèi)源性裝載是對(duì)親本細(xì)胞進(jìn)行修飾，使其分泌的外泌體載有功能分子，將治療藥物分子在外泌體生成過程中整合到外泌體內(nèi)，讓細(xì)胞成為載藥外泌體的活工廠，直接生成想要的外泌體。內(nèi)源裝載是在產(chǎn)生外泌體的細(xì)胞上做文章，根據(jù)外泌體產(chǎn)生的過程對(duì)細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)改造修飾，通常涉及蛋白/多肽的融合表達(dá)、基因藥物的過表達(dá)等，讓其產(chǎn)生攜帶目標(biāo)分子的外泌體。與外源裝載相比，內(nèi)源裝載的實(shí)驗(yàn)難度更大，周期更長。

       外源性裝載是在分離天然外泌體后，對(duì)收集到的外泌體進(jìn)行相應(yīng)的藥物裝載，包括直接共孵育法、超聲法、電穿孔法、擠出法和反復(fù)凍融法，相比內(nèi)源裝載，外源裝載操作更簡單，批次間的穩(wěn)定性更高，更適合放大化生產(chǎn)。

       ①直接共孵育法是直接將外泌體與藥物放在一起孵育，藥物沿著濃度梯度與外泌體融合，包載效率取決于藥物的極性大小，疏水性的藥物裝載率高于親水性藥物，同時(shí)分子量較小的藥物更容易穿過外泌體膜進(jìn)入外泌體。雖然此種裝載方式對(duì)設(shè)備要求低且簡便易行，但是其裝載效率偏低，且載藥效率易受藥物分子量、親疏水性的影響，因此直接共孵育法的應(yīng)用受到了限制。

       ②超聲法是將外泌體與小分子或蛋白質(zhì)藥物混合，然后通過均質(zhì)探頭超聲破壞外泌體膜的完整性，從而實(shí)現(xiàn)藥物的包載。外泌體膜上磷脂分子之間結(jié)構(gòu)比較緊密，限制了外泌體的載藥效率。超聲波能提供能量和機(jī)械力，使外泌體膜上暫時(shí)形成孔隙，從而使得藥物分子更容易進(jìn)入外泌體。在超聲處理后，載藥外泌體需要在特定的溫度下孵育至少1 h，讓外泌體膜結(jié)構(gòu)恢復(fù)。超聲法具有載藥效率高、能持續(xù)釋藥的優(yōu)點(diǎn)，不過也可能導(dǎo)致外泌體聚集并影響其表面蛋白結(jié)構(gòu)。

       ③電穿孔法是通過電場作用，使懸浮在導(dǎo)電溶液中的外泌體膜上形成可恢復(fù)的微小孔道，藥物或核酸可通過這些微孔擴(kuò)散進(jìn)入外泌體內(nèi)部。該法操作簡便，已廣泛應(yīng)用于包載小干擾 RNA(siRNA) 或微小核糖核酸 (microRNA 或 miRNA)，但同時(shí)可能導(dǎo)致RNA沉淀或外泌體聚集，降低藥物裝載效率。

       ④擠出法是將外泌體與藥物的混合物裝入具有多孔膜（一般孔徑為100～400 nm）的脂質(zhì)擠出機(jī)中，在擠壓過程中實(shí)現(xiàn)藥物包載。該法載藥效率高，所得到的外泌體粒徑均一，不過該法的機(jī)械力可能會(huì)改變外泌體膜的性質(zhì)，如膜電位、膜蛋白結(jié)構(gòu)等。

       ⑤反復(fù)凍融法是將藥物與外泌體在室溫下孵育一段時(shí)間，再在-80 ℃或液氮條件下迅速冷凍，然后解凍，在快速冷凍過程中形成的冰晶可使外泌體脂質(zhì)膜破裂，然后在緩慢融化的過程中，暴露出的脂質(zhì)重新融合，并將藥物包封于其中，如此重復(fù)至少3次，可保證藥物的包封。該法操作簡單、條件溫和、不易破壞生物活性物質(zhì)、有大規(guī)模生產(chǎn)的前景，但是會(huì)誘導(dǎo)外泌體的聚集且包封率一般低于超聲或擠出法。

       外泌體載藥的應(yīng)用

       1、癌癥的基因治療

       研究表明，利用腫瘤外泌體裝載miRNA126 可用于治療非小細(xì)胞肺癌。由于腫瘤外泌體具有組織偏向性，裝載miRNA126 的腫瘤外泌體能夠聚集在肺癌組織中抑制腫瘤的生長。利用天然牛奶來源的外泌體裝載siRNA靶向可作用于血管內(nèi)皮 生長因子（VEGF）、EGFR、蛋白激酶B（AKT）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和鼠類肉瘤病毒癌基因（KRAS），從而抑制肺癌轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，將siRNA裝載進(jìn)外泌體后，可以顯著地減少siRNA 的降解，而且在多種腫瘤細(xì)胞中，靶基因的表達(dá)被顯著抑制。利用骨髓提取的間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體裝載 miR-142-3p 核苷酸抑制劑來抑制乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的 miR-142-3p 的表達(dá)，研究結(jié)果表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可以在最快3 h內(nèi)將基于鎖核酸修飾的miR-142-3p 抑制序列遞送到乳腺癌細(xì)胞中，并下調(diào)該細(xì)胞中miR-142-3p 的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的治療。

       2、癌癥的小分子治療

       研究證實(shí)，抗癌藥物如紫杉醇(PTX)和阿霉素( DOX)能夠成功載入外泌體，進(jìn)而用于抗腫瘤治療。通過利用外泌體運(yùn)送紫杉醇到對(duì)應(yīng)的腫瘤部位進(jìn)行抗腫瘤的研究中，由于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可自主歸巢至腫瘤微環(huán)境，所以不需要通過基因操作就能夠有效的輸送紫杉醇而且不會(huì)破壞其生物活性，即使小泡溶液蛋白質(zhì)濃度較低時(shí)也可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。體外試驗(yàn)表明，其對(duì)癌細(xì)胞的抑制效果與單純使用紫杉醇的效果相比基本一致。

       有學(xué)者利用透明質(zhì)酸修飾外泌體并裝載阿霉素用于抑制CD44表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞，因?yàn)橥该髻|(zhì)酸可以與腫瘤細(xì)胞表面蛋白CD44 高度特異性結(jié)合，而A549 和 MDA-MB-231 等腫瘤細(xì)胞表面的CD44 高表達(dá)，所以透明質(zhì)酸修飾的外泌體能夠特異性地靶向CD44 高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。利用原位瘤細(xì)胞分泌的外泌體裝載阿霉素用于預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移，從原位瘤細(xì)胞脫落到血管的腫瘤細(xì)胞會(huì)在遠(yuǎn)端形成轉(zhuǎn)移位點(diǎn)，而原位癌來源的外泌體上具有同樣的靶向蛋白能到達(dá)特定的預(yù)轉(zhuǎn)移位點(diǎn)，利用這一特性載藥外泌體可特異性地聚集到預(yù)轉(zhuǎn)移位點(diǎn)干預(yù)腫瘤轉(zhuǎn)移。

       3、外泌體載藥用于其他疾病

       研究報(bào)道，裝載有IL-10(白細(xì)胞介10)的樹突狀細(xì)胞分泌的外泌體具有免疫抑制作用，可降低T細(xì)胞增殖。在小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎體內(nèi)模型研究表明，單劑量的治療性外泌體可有效地抑制了疾病的進(jìn)展，并降低關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。類似的，樹突狀細(xì)胞來源的裝載有IL-4(白細(xì)胞介素4) 的外泌體能夠緩解小鼠關(guān)節(jié)炎模型中關(guān)節(jié)炎的癥狀，并降低小鼠關(guān)節(jié)炎的炎癥程度。杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥( DMD) 是一種常見的 X 染色體相關(guān)的疾病，一直沒有較好的治療方法。研究人員發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體通過遞送 miR-29c，可以增加成肌細(xì)胞的分化，同時(shí)降低 DMD患者成肌細(xì)胞中成纖維基因的表達(dá)，在DMD 患者的治療中有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。外泌體載藥還被運(yùn)用到神經(jīng)元的治療中，使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體裝載重組CD63-GFP慢病毒質(zhì)粒，研究證實(shí)了外周神經(jīng)末梢對(duì)外泌體的攝取，以及外泌體可以逆行運(yùn)輸藥物到DRG(背根節(jié)) 神經(jīng)元和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。該研究提出了一種針對(duì)神經(jīng)元疾病的新的藥物遞送方法。肝纖維化是一種是由慢性肝損傷期間纖維瘢痕組織過度沉積引起的一種廣泛的肝臟疾病。肝星狀細(xì)胞來源的外泌體遞送miR-214 到肝細(xì)胞中，能夠降低CCN2 蛋白的表達(dá)，從而降低肝臟的纖維化。姜黃素是一種黃色 色 素，主要提取于姜黃的根莖中，具有抵抗炎癥、促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)、抵抗惡性細(xì)胞增殖、疏風(fēng)散寒、抗氧化、抗血管生成及保護(hù)肝臟、提高肝臟解毒能力等功效。不過姜黃素在臨床應(yīng)用方面存在水溶性較低、體內(nèi)代謝速度快等問題，因此在機(jī)體容易被快速清除。利用外泌體作為包載姜黃素和大黃素的載體，可以天然提高姜黃素和大黃素在機(jī)體水環(huán)境中的溶解性、穩(wěn)定性和生物利用度等。此外，血腦屏障是腦部疾病給藥的障礙，外泌體以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、表面特殊的蛋白，能夠穿過血腦屏障，將藥物運(yùn)載到腦組織中。研究表明，載有過氧化氫酶的外泌體可成功通過血腦屏障進(jìn)入大腦，改善帕金森病的疾病狀態(tài)。

       參考資料

       [1]張盈盈,陳麗青,劉璇等.外泌體作為藥物遞送載體的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2019,54(06):1010-1016.

       [2]周建芬,柴芝蘭,謝操等.外泌體作為藥物遞送載體的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2020,51(04):425-433.

       [3]解曉東,練殊.基于外泌體的納米載體研究進(jìn)展[J].閩江學(xué)院學(xué)報(bào),2022,43(05):56-67.

       作者簡介：@小泥沙，食品科技工作者，食品科學(xué)碩士，現(xiàn)就職于國內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事營養(yǎng)食品的開發(fā)與研究。