結(jié)核防治日 | 談?wù)効菇Y(jié)核藥物靶點(diǎn)研究新進(jìn)展

       3月24日是第28個(gè)世界防治結(jié)核病日，今年的主題是："你我共同努力 終結(jié)結(jié)核流行"。

       結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一種慢性致死性疾病，近些年來(lái)，由于抗結(jié)核藥物的大量使用，抗結(jié)核作用位點(diǎn)的突變，耐多藥結(jié)核?。∕DR-TB）和廣泛耐藥結(jié)核?。╔DR-TB）成為控制和治療結(jié)核病的重大挑戰(zhàn)。

       鏈霉素(streptomycin，SM)和對(duì)氨基水楊酸(p-amino salicylic acid，PAS) 是最早被發(fā)現(xiàn)并用于治療TB的藥物。隨后，異煙肼(INH)的出現(xiàn)形成了" INH+SM+PAS"的三聯(lián)療法，基于患者的藥源和耐受性，其中的PAS可選用氨硫脲(TB1)或乙胺丁醇(EMB)替換。1965年利福平(RIF)開(kāi)始應(yīng)用于臨床后，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)"INH+RIF"可將治療療程減短到9個(gè)月，再進(jìn)一步與吡嗪酰胺(PZA)結(jié)合使用能夠使療程減短至半年。此后，相關(guān)研究一直沒(méi)有研發(fā)出應(yīng)用于TB治療的全新結(jié)構(gòu)藥物。近幾十年來(lái)僅有強(qiáng)生公司的新型結(jié)核分枝桿菌ATP合酶抑制劑貝達(dá)喹啉（bedaquiline）和日本大冢公司的德拉馬尼（delamanid）兩種抗結(jié)核藥物被批準(zhǔn)上市，而目前已有耐藥菌株出現(xiàn)及引起副作用的報(bào)道。因此，尋找新的抗結(jié)核藥物作用靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)新型抗結(jié)核藥物迫在眉睫。

       結(jié)核病的防治和新藥研發(fā)首先需要發(fā)現(xiàn)和闡明其致病菌關(guān)鍵生理活動(dòng)的分子機(jī)制。其中，結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁合成過(guò)程、DNA/RNA合成和能量代謝過(guò)程被認(rèn)為是理想突破口，許多抗結(jié)核藥物和在研藥物均作用于這些重要生理途徑。

       與細(xì)胞壁有關(guān)的藥物靶點(diǎn)

       結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和組成，是病原體抵抗環(huán)境壓力，免受抗生素殺傷和逃避宿主免疫反應(yīng)的天然屏障。其結(jié)構(gòu)和組成與革蘭氏陽(yáng)性/陰性細(xì)菌以及真菌都存在顯著差異，結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁組分肽聚糖(peptidoglycan, PG)、阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan, AG)、分枝菌酸(mycolic acid, MA)、脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan,LAM)等均是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的分子，其合成、運(yùn)輸、組裝、調(diào)控等需要一系列酶和轉(zhuǎn)運(yùn)膜蛋白參與完成。破壞細(xì)胞壁的完整性不僅有助于殺菌藥物的進(jìn)入，還會(huì)嚴(yán)重地影響病原體的生存，故細(xì)胞壁合成通路中的關(guān)鍵蛋白被公認(rèn)為是很好的藥物靶標(biāo)。

       ①DprE(decaprenylphosphoryl-D-ribose 2'-epimerase)。DprE是由DprE1和DprE2構(gòu)成的異二聚體，在D-核糖向D-阿拉伯呋喃糖(DPA)的轉(zhuǎn)化中起重要作用，而DPA是合成細(xì)胞壁阿拉伯聚糖的唯一前體。目前研發(fā)的抑制劑主要針對(duì)DprE1，包括苯并噻嗪酮類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)和氮雜吲哚類(lèi)，其中氮雜吲哚衍生物TBA-7371處于臨床試驗(yàn)的第一階段。

       ②分枝桿菌膜蛋3(Mmp L3)。Mmp L3主要參與Mtb的脂質(zhì)運(yùn)輸、聚合和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等功能，是近期發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)治療藥物靶點(diǎn)。到目前為止，大約有8類(lèi)不同分子構(gòu)型的具有抗菌活性的MmpL3抑制劑被發(fā)現(xiàn)，其中乙二胺類(lèi)的SQ109已處于2b-3期臨床試驗(yàn)階段。該小分子對(duì)耐藥菌株有很好的殺菌效果，具有極低的耐藥突變率，有望成為新的抗結(jié)核治療藥物。

       ③L-鼠李糖合成相關(guān)酶。L-鼠李糖連接細(xì)胞壁肽聚糖和阿拉伯半乳聚糖（AG）兩種組分，通過(guò)抑制其合成，可以影響MTB細(xì)胞壁的正常合成及生存。由于人體內(nèi)不存在L-鼠李糖，所以L(fǎng)-鼠李糖合成中相關(guān)酶可以作為具有較好選擇性的藥物靶點(diǎn)。L-鼠李糖的合成主要涉及4種酶促反應(yīng)，參與反應(yīng)的4種酶分別為葡萄糖-1-磷酸脫氧胸苷轉(zhuǎn)移酶（RmlA）、dTDP-D-葡萄糖-4,6-脫水酶（RmlB）、dTDP-4-酮基-6-脫氧葡萄糖差向異構(gòu)酶（RmlC）和 dTDP-4-酮-鼠李糖還原酶（RmlD）。其中Rml C因其結(jié)構(gòu)的特殊和底物的高特異性，以及對(duì)輔酶因子無(wú)依賴(lài)性而在研究領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，但目前尚無(wú)相關(guān)的抑制劑上市。

       ④阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶。細(xì)胞壁阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶EmbA、EmbB和EmbC均是參與細(xì)胞壁阿拉伯聚糖合成的阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶，屬于糖基轉(zhuǎn)移酶超家族GT-C中的GT-53家族。其中，EmbA和EmbB參與阿拉伯半乳聚糖AG的合成，而EmbC參與脂阿拉伯甘露聚糖LAM的合成。Emb蛋白均是利用D-阿拉伯呋喃糖(DPA)作為阿拉伯糖供體，將阿拉伯單糖轉(zhuǎn)移至特定的阿拉伯聚糖受體上，完成阿拉伯聚糖的延伸或者分枝。Emb蛋白的活性測(cè)試表明，乙胺丁醇可以抑制其活性，因而是這些蛋白的直接作用靶點(diǎn)。研究表明，結(jié)核桿菌中的Emb蛋白均是無(wú)法敲除的關(guān)鍵蛋白，而一線(xiàn)藥物乙胺丁醇的臨床耐藥突變大多發(fā)生在Emb蛋白上，尤其集中在EmbB蛋白。

       ⑤烯?；d體蛋白還原酶。烯酰基載體蛋白還原酶(Inh A)在細(xì)胞壁脂肪酸合成方面發(fā)揮著重要作用，是一線(xiàn)藥物異煙肼(INH)的一個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。INH屬于一類(lèi)前體藥物，依賴(lài)于KatG酶將其激活，而KatG的基因突變會(huì)阻斷該激活途徑并導(dǎo)致耐藥。因此現(xiàn)在許多研究聚焦于Inh A的"直接抑制劑"。三氯生(TCS)屬于一類(lèi)廣譜抗生素，可對(duì)Inh A造成可逆、溫和的抑制。

       ⑥D(zhuǎn)-丙氨酸-D-丙氨酸連接酶A(D-Alanyl-D-alanine ligase A，DdlA)能在ATP的介導(dǎo)下促進(jìn)D-丙氨酸(Ala)分子的二聚化，獲得D-丙氨酰-D-Ala。其產(chǎn)物與肽聚糖(PG)的五肽生物合成相關(guān)，能顯著影響Mtb細(xì)胞壁的正常功能。D-環(huán)絲氨酸(DCS)是DdlA的抑制劑，可抑制菌株的生長(zhǎng)。

       ⑦HspX蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，在宿主巨噬細(xì)胞中，低氧水平會(huì)誘導(dǎo)分枝桿菌細(xì)胞壁中的HspX高度表達(dá)，表明它在TB感染的潛伏期中起著重要作用。由于治療期間人體容易產(chǎn)生抗生素耐藥性，因此通過(guò)接種疫 苗進(jìn)行早期預(yù)防是控制感染的有效途徑之一?？ń槊?Bacillus calmette-guerin，BCG)是目前可用的唯一結(jié)核病疫 苗。有學(xué)者通過(guò)編碼融合HspX-PPE44-EsxV抗原，得到了一種新型DNA疫 苗，并在BALB/c小鼠感染模型中測(cè)試，結(jié)果表明，HspX融合疫 苗可以在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)高水平的特定細(xì)胞因子，而且在BCG增強(qiáng)免疫方案中使用該DNA疫 苗可產(chǎn)生大量的IFN-γ、IL-12和TGF-β等細(xì)胞因子，從而取得更好的療效。

       與DNA/RNA 合成有關(guān)的藥物靶點(diǎn)

       ①DNA回旋酶。DNA回旋酶由兩個(gè)亞蛋白單元A（GyrA）和 B（GyrB）以異源四聚體的形式存在，DNA回旋酶在人體內(nèi)不存在，但卻是細(xì)菌生存的必需物質(zhì)，抑制其作用可導(dǎo)致細(xì)菌死亡。氧氟沙星、左氧氟沙星和莫西沙星等喹諾酮類(lèi)抗結(jié)核藥物主要作用于結(jié)核分枝桿菌GyrA蛋白，阻止DNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而殺死MTB。近年來(lái)，由于GyrA亞基易發(fā)生氟喹諾酮類(lèi)耐藥突變，藥物研究及靶點(diǎn)篩選已轉(zhuǎn)向GyrB亞基，相繼出現(xiàn)了一些以GyrB 為靶點(diǎn)的藥物，如苯并咪唑、尿素酶等。

       ②RNA 聚合酶。RNA聚合酶在Mtb和真核生物中的結(jié)構(gòu)存在一定差別?？股乩Ｆ?RIF)對(duì)快速增殖期和間斷繁殖的Mtb 殺菌力都很強(qiáng)，與鏈霉素和異煙肼聯(lián)用時(shí)可使它們的治療效果增強(qiáng)RIF耐藥性的產(chǎn)生主要是由 RNA 聚合酶 β 亞基的 rpoB 基因突變所致。

       ③次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶。次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）是一種細(xì)胞質(zhì)酶，在體內(nèi)廣泛存在，它不僅參與嘌呤堿基的補(bǔ)救合成途徑，對(duì) DNA/RNA 的合成起重要作用，而且關(guān)系到嘌呤類(lèi)藥物的代謝，是調(diào)控該類(lèi)藥物藥理效應(yīng)和毒 性反應(yīng)的關(guān)鍵酶，兩種吡咯烷核苷磷酸鹽是目前針對(duì)Mtb-HGPRT最有效的抑制劑。

       ④胸苷酸激酶。胸苷酸激酶(TMK)是一種核苷單磷酸激酶，在嘧啶合成中起關(guān)鍵作用，對(duì)細(xì)菌的DNA合成至關(guān)重要。TMK可催化ATP和脫氧胸苷-5'-單磷酸(dTMP)之間的可逆磷酸化，產(chǎn)生ADP和脫氧胸苷-5'-二磷酸(dTDP)，并通過(guò)再次磷酸化得到胸苷5'-三磷酸(dTTP)。 Mtb-TMK在人體中的低同源性使其成為潛在的藥物靶點(diǎn)。通過(guò)高通量篩選和核磁共振的方法，發(fā)現(xiàn)了兩類(lèi)新型 TMK抑制劑，分別是氰基吡啶酮類(lèi)和萘啶類(lèi)。以往的TMK 抑制劑都是胸苷單磷酸類(lèi)似物或者是含有胸苷單磷酸結(jié)構(gòu)，而這兩類(lèi)化合物是非胸腺嘧啶核苷類(lèi) TMK抑制劑，對(duì)TMK具有較好的選擇性。

       與能量代謝有關(guān)的藥物靶點(diǎn)

       在近年的研究中，針對(duì)結(jié)核分枝桿菌能量代謝系統(tǒng)，特別是氧化磷酸化途徑的靶標(biāo)研究已成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。雖然病原菌的有氧呼吸與真核生物類(lèi)似，都依賴(lài)于一系列蛋白質(zhì)復(fù)合體，包括NADH、琥珀酸、細(xì)胞色素c氧化還原酶和ATP合成酶，但是其結(jié)構(gòu)和組裝形式與真核線(xiàn)粒體和革蘭氏陽(yáng)性/陰性細(xì)菌均存在顯著差異，其獨(dú)特的特點(diǎn)使相關(guān)復(fù)合物成為理想的藥物靶點(diǎn)。

       ①ATP合成酶。Mtb中的ATP合酶是一種含有多個(gè)亞基的跨膜蛋白復(fù)合物，參與幾乎所有活細(xì)胞的能量代謝和部分細(xì)胞間的信號(hào)傳遞。由atpE基因編碼的ATP合酶C亞基是抑制劑貝達(dá)喹啉的主要作用靶點(diǎn)。但基因突變導(dǎo)致的貝達(dá)喹啉耐受加上貝達(dá)喹啉所導(dǎo)致的心律失常及惡心、頭痛一系列副作用，限制了其臨床應(yīng)用。對(duì)一系列雙喹啉衍生物評(píng)估發(fā)現(xiàn)，貝達(dá)喹啉SAR衍生的TBAJ-587和TBAJ-876化合物在體外和小鼠結(jié)核病模型研究中均顯示出其對(duì)TB的潛在療效，目前兩類(lèi)化合物皆處于臨床研究的第一階段。

       ②細(xì)胞色素bc1: aa3。Mtb的細(xì)胞色素bc1: aa3是由甲萘醌、細(xì)胞色素c、還原酶(bc1)和細(xì)胞色素aa3型氧化酶組成的復(fù)合體，主要在呼吸鏈中發(fā)揮電子傳遞效能，顯著影響ATP的合成。咪唑并[1, 2-α]吡啶類(lèi)化合物Q203是針對(duì)細(xì)胞色素bc1: aa3復(fù)合體中細(xì)胞色素b亞基 (the cytochrome b subunit， QcrB)而研發(fā)的抑制劑，目前處于臨床研究的第二階段。

       ③莽草酸激酶。莽草酸途徑的終產(chǎn)物是分支酸鹽，是一種芳香族氨基酸和甲基萘醌等物質(zhì)的前體。在該途徑中起關(guān)鍵作用的是莽草酸激酶 (shikimate kinase，SK)，該途徑只存在于細(xì)菌、真菌、藻類(lèi)和植物中，人體內(nèi)不存在該途徑，所以此途徑中的關(guān)鍵酶可以作為抗結(jié)核靶點(diǎn)。目前對(duì)SK 的研究大多數(shù)停留在通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)，對(duì)天然底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造指導(dǎo)合成底物類(lèi)似物階段，但合成的化合物與SK 的親和力往往較好，也預(yù)示了SK作為抗結(jié)核藥物靶點(diǎn)的廣闊前景。

       ④細(xì)胞色素P450酶系。細(xì)胞色素P450 (cytochromeP450， CYPs) 是一類(lèi)具有混合功能的氧化還原酶，在細(xì)胞合成與分解代謝活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。許多細(xì)菌P450 酶系的酶不超過(guò)5種，大腸桿菌中甚至沒(méi)有P450 酶系，而在MTB中P450 酶系卻含有20 多種酶，表明其在MTB代謝中發(fā)揮著重要的作用，也表明其中的一些酶很有可能成為新的抗結(jié)核藥物靶點(diǎn)。近年來(lái)，對(duì)MTB中P450 酶系CYP51、CYP121和CYP141的研究較多。氯法齊明(Cfz)被視作核心二線(xiàn)藥物，體外鑒定結(jié)果顯示其可有效抑制CYPs。

       近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和研究水平的提高，結(jié)核桿菌在分子水平上的生理功能得以精確闡釋?zhuān)鄠€(gè)藥物和候選化合物的靶向作用機(jī)制得到了詳細(xì)的闡明，相關(guān)的結(jié)合位點(diǎn)及其結(jié)合方式為新型抗結(jié)核小分子的開(kāi)發(fā)提供了非常有價(jià)值的信息。相信不久的將來(lái)，對(duì)于這些靶點(diǎn)的新藥開(kāi)發(fā)一定會(huì)取得重要突破。

       參考資料

       [1]吳疆,崔嘉偉,薛云新,王岱.抗結(jié)核藥物靶點(diǎn)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)抗生素雜志,2022,47(11):1119-1127.DOI:10.13461/j.cnki.cja.007423.

       [2]王霞,朱寧嶼,姜威,司書(shū)毅.抗結(jié)核藥物靶點(diǎn)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù),2018,13(03):259-264.

       [3]陳曉博,李俊.抗結(jié)核藥物靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展[J].自然雜志,2021,43(05):335-342.

       作者簡(jiǎn)介：小泥沙，食品科技工作者，食品科學(xué)碩士，現(xiàn)就職于國(guó)內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事?tīng)I(yíng)養(yǎng)食品的開(kāi)發(fā)與研究