諾如病毒的檢測(cè)及其疫 苗研發(fā)進(jìn)展

       近期，由諾如病毒（NoV）感染導(dǎo)致的病毒 性胃腸炎進(jìn)入高發(fā)期，引起全民廣泛關(guān)注。上篇，我們介紹了抗諾如病毒相關(guān)靶點(diǎn)藥物。這篇，我們著重介紹諾如病毒的檢測(cè)及其疫 苗研發(fā)進(jìn)展情況。

       諾如病毒的檢測(cè)

       科學(xué)檢測(cè)是諾如病毒防控管理的基礎(chǔ)，能夠準(zhǔn)確地為患者病情評(píng)估奠定基礎(chǔ)，提高疾病處置能力。目前 NoV 檢測(cè)方法主要有電鏡法、核酸檢測(cè)法和蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)。電鏡法為NoV最早檢出的方法，其靈敏度相對(duì)較低，故標(biāo)本中病毒的檢測(cè)范圍須≧106才可檢出，另外，對(duì)操作技術(shù)也要求較高，所以不適用于臨床診斷。

       核酸檢測(cè)是常見的檢測(cè)技術(shù)之一，是 NoV 檢測(cè)的主要方法及金標(biāo)準(zhǔn)，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。核酸擴(kuò)增法包括常規(guī) RT-PCR 檢測(cè)、多重 RT-PCR 檢測(cè)、熒光定量 PCR 技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。常規(guī) RT-PCR 檢測(cè)是在臨床檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用過(guò)程中以逆轉(zhuǎn)錄 PCR識(shí)別為主形成的一種檢測(cè)技術(shù)，能夠滿足患者的檢測(cè)需求，在檢測(cè)過(guò)程中，能有效的評(píng)估患者病情。雜交技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）不僅能更準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)標(biāo)本中低濃度的NoV感染，還可以進(jìn)一步對(duì)病毒進(jìn)行基因型的研究，不會(huì)受到獲得分型單克隆抗體的限制，對(duì)流行病學(xué)研究具有重要意義。多重RT-PCR 檢測(cè)敏感性更高，特異性更強(qiáng)，檢測(cè)速度更快，應(yīng)用于臨床檢測(cè)工作中，對(duì)提高診斷質(zhì)量有積極作用。多重RT-PCR 技術(shù)是在同一個(gè) PCR 反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物以檢測(cè)不同類型或亞型的病毒，它可以同時(shí)檢測(cè)多種不同型別的病毒，減少反應(yīng)次數(shù)，節(jié)約時(shí)間，但該方法靈敏度較低，因此需要優(yōu)化 PCR 反應(yīng)條件來(lái)盡可能減少非特異擴(kuò)增。熒光定量PCR技術(shù)借助探針技術(shù)對(duì)NoV的分布情況作出分析評(píng)價(jià)，能夠在診斷過(guò)程中通過(guò)熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)對(duì)病毒的傳播形式及病毒載體進(jìn)行識(shí)別，提高臨床疾病診斷準(zhǔn)確率。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種以基因擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)的新型檢測(cè)技術(shù)，具有簡(jiǎn)單、快速及超高的靈敏度，該技術(shù)應(yīng)用能夠滿足患者診斷工作實(shí)際需求，具有廣泛的應(yīng)用前景，尤其是對(duì)于欠發(fā)達(dá)或偏遠(yuǎn)地區(qū)的臨床診斷和傳染病監(jiān)測(cè)具有重要的作用。此外，基因芯片技術(shù)是一種大規(guī)模集成的固相雜交技術(shù)，其基本原理是以核酸分子雜交即依據(jù) DNA 雙鏈堿基互補(bǔ)配對(duì)、變性和復(fù)性的原理，以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA 或基因片段作為探針，檢測(cè)樣品序列及其互補(bǔ)序列，然后通過(guò)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，可定性或定量檢測(cè)，與傳統(tǒng)基因診斷技術(shù)相比，DNA 芯片技術(shù)具有微型化、高通量、高度平行性和高速性的特點(diǎn)。

       蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)也是NoV檢測(cè)過(guò)程中常用的檢測(cè)技術(shù)之一，可以有效識(shí)別病毒載體，對(duì)病毒的追蹤有一定意義。蛋白質(zhì)檢測(cè)方法的原理主要是利用NoV特異性單（多）克隆抗體與標(biāo)本中NoV衣殼抗原特異結(jié)合而進(jìn)行檢測(cè)，目前利用該技術(shù)的檢測(cè)試劑盒已被臨床廣泛應(yīng)用。該方法的靈敏度和特異性與抗原和抗體的差異性有關(guān)，目前較常用的免疫學(xué)方法包括 ELISA 技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)等。此外，免疫層析技術(shù)結(jié)合了免疫親和作用及層析技術(shù)，可用于快速檢測(cè)NoV，具有節(jié)約時(shí)間，操作方便的優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛用于臨床檢測(cè)。

       諾如病毒的疫 苗研發(fā)

       目前針對(duì)NoV引發(fā)的疾病尚無(wú)有效的治療和預(yù)防手段，因此對(duì)于易感人群以及群發(fā)性感染，研發(fā)相關(guān)疫 苗是必不可少的。由于未找到合適的細(xì)胞系對(duì)NoV 進(jìn)行體外培養(yǎng)，滅活和減毒疫 苗的研發(fā)受到極大限制，但隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，基于NoV重組抗原的基因工程疫 苗進(jìn)人了人們的視野。目前主要研發(fā)了基于P 顆粒、病毒樣顆粒(VLPs)和重組腺病毒載體的 NoV 候選疫 苗。

       1、NoV P 顆粒疫 苗

       P 顆粒是由RGD4C 肽修飾的P結(jié)構(gòu)域( P domain, PD) 二聚化并進(jìn)一步聚集形成，具有真實(shí)組織血型抗原(HBGA)受體結(jié)合特性，可在大腸埃希菌中大量表達(dá)，生產(chǎn)簡(jiǎn)單，成本低。VP1蛋白中的P結(jié)構(gòu)域可以在體外自發(fā)組裝形成亞病毒顆粒P顆粒，該顆粒由12個(gè)P結(jié)構(gòu)域二聚體組成，P 結(jié)構(gòu)域的環(huán)狀結(jié)構(gòu)經(jīng)自我組裝后存在于顆粒的外表面，適合外源抗原的插入與展示，所以 P 顆粒不僅可以作為載體遞呈外源抗原，也可以作為NoV疫 苗抗原。P 顆粒形態(tài)和大小與 NoV 差距較大，免疫原性可能較真實(shí)的病毒粒子低。但有研究發(fā)現(xiàn)，P顆粒和VLPs 均能很好地被樹突狀細(xì)胞( dendritic cell, DC)遞呈，體液免疫和細(xì)胞免疫的免疫原性相似，且鼻內(nèi)接種 NoV P 顆粒疫 苗對(duì) NoV 急性胃腸炎具有交叉保護(hù)作用，保護(hù)效力與VLPs 疫 苗相當(dāng)，所以 P 顆粒仍可作為一種良好的候選疫 苗。

       聯(lián)合疫 苗不僅提高了免疫效率，還降低了成本，是P顆粒疫 苗較VLPs 疫 苗的另一大優(yōu)勢(shì)。研究顯示，大腸埃希菌系統(tǒng)表達(dá)的P 顆粒嵌合疫 苗包含NoV G II. 4和RV中和抗原VP8、可以誘導(dǎo)針對(duì)RV VP8以及NoV P抗原的強(qiáng)烈免疫應(yīng)答，并且保護(hù)小鼠免受RV感染。此外，NoV P顆粒分別與流感病毒、戊型肝炎病毒組成二聯(lián)疫 苗，與戊型肝炎病毒以及星狀病毒組成三聯(lián)疫 苗，免疫BALB/c小鼠后均可以引起免疫應(yīng)答。同時(shí)，這些免疫血清阻斷NoV 與HBGA結(jié)合的效率也更高。這些疫 苗免疫結(jié)果表明，P 顆?？梢杂米黝A(yù)防NoV及相關(guān)病毒的候選疫 苗成分。

       2、 NoV VLPs 疫 苗

       VLPs保留了與人類組織血型抗原（HBGA）結(jié)合的能力、病原相關(guān)分子模式以及高密度B細(xì)胞和T細(xì)胞表位，可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液以及細(xì)胞免疫應(yīng)答。目前用于表達(dá)NoV VLP的表達(dá)系統(tǒng)主要轉(zhuǎn)基因植物、酵母和各種病毒載體，如桿狀病毒、新城疫病毒（NDV)、水皰性口炎病毒(VSV )、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE )及甲病毒等。

       研究發(fā)現(xiàn)，BALB/c小鼠口服轉(zhuǎn)基因植物(馬鈴薯、番茄和煙草)表達(dá)的NoV VLP后，可以檢測(cè)到特異性血清Ig G以及分泌型IgA，在此基礎(chǔ)上將煙草表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，可使表達(dá)的GI和GⅡ.4VLP產(chǎn)量增加到毫克級(jí)。用表達(dá)GⅡ.4 VLP的畢赤酵母提取物(0. 1 mgVLP，無(wú)佐劑）口服免疫BALB/c小鼠，可引起體液和黏膜免疫應(yīng)答；以更高劑量（1 mgVLP )免疫時(shí)，免疫應(yīng)答時(shí)間提前且更為強(qiáng)烈，相比于口服免疫，通過(guò)鼻內(nèi)免疫VLP (無(wú)佐劑)更能刺激免疫應(yīng)答，以大腸埃希菌不耐熱腸毒素R192G突變體為佐劑更增強(qiáng)了免疫應(yīng)答。將從蘆薈中提取的惰性原位膠凝多糖干粉制劑與煙草表達(dá)的NoV VLP混合，制成干粉疫 苗鼻內(nèi)免疫豚鼠，產(chǎn)生的抗體滴度不低于含佐劑的VLP疫 苗。

       桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞是最為常用的病毒載體表達(dá)系統(tǒng)。NoV和輪狀病毒（RV）是引起幼兒病毒 性腹瀉的主要病原體，而腸道病毒71 型（enterovirus 71，EV 71)是導(dǎo)致手足口病的主要病原體，有學(xué)者利用桿狀病毒載體研發(fā)了 NoV (G II.4)和 EV71二聯(lián)疫 苗以及NoV(G I .3 和GⅡ.4)和 RV (VP6)二聯(lián)疫 苗。將NoV (G II.4)和 EV71各 5μg VLP 疫 苗經(jīng)腹腔注射免疫BALB/c小鼠，可引發(fā)長(zhǎng)時(shí)間的抗 GII.4NoV和EV71免疫應(yīng)答，且抗體滴度與2種疫 苗單獨(dú)免疫后誘導(dǎo)的滴度相當(dāng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NoV 和RV二聯(lián)疫 苗誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，在動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)到了高水平的血清特異性抗NoV 和RVIgG以及IgA 抗體，這些特異性抗體效價(jià)在6 個(gè)月內(nèi)保持恒定水平。同時(shí)，血清特異性抗NoV 抗體可以阻斷VLP與HBGA的結(jié)合，具有中和NoV的作用。聯(lián)合疫 苗免疫原性研究表明，NoV與EV71和RV疫 苗不同抗原之間均沒(méi)有免疫干擾，可以作為良好的候選疫 苗。

       與桿狀病毒載體表達(dá)的VLP相比，重組水皰性口炎病毒(VSV)和新城疫病毒(rVSV 、rNDV)作為載體表達(dá)的NoV VLP可以在BALB/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)更強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。rNDV載體主要誘導(dǎo)針對(duì)Th1應(yīng)答的IgG2a 亞類抗體，具體表現(xiàn)為在脾細(xì)胞中檢測(cè)到高水平的IFN-γ、TNF-a 和IL-2。與之類似的是，接種委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)和甲病毒載體表達(dá)的NoV VL P也導(dǎo)致了小鼠特異性全身和黏膜免疫應(yīng)答。

       3、NoV 重組腺病毒載體疫 苗

       腸道上皮細(xì)胞是NoV的自然宿主細(xì)胞，NoV 口服疫 苗可引起腸內(nèi)局部黏膜免疫反應(yīng)，防止病毒感染。美國(guó) Vaxart制藥公司利用其成熟的腺病毒載體口服疫 苗研發(fā)平臺(tái)，研制出了一種由表達(dá)GI. 1 NoV VP1基因的非復(fù)制型腺病毒載體和雙鏈 RNA 佐劑組成的片狀疫 苗，單次免疫后能有效誘導(dǎo)效應(yīng)性和記憶性 B 細(xì)胞黏膜免疫，在免疫后6個(gè)月，糞便IgA 反應(yīng)仍較高，HBGA阻斷抗體水平增加，疫 苗安全且耐受性良好。繼而，Vaxart 公司研發(fā)出了GII.4 單價(jià)口服疫 苗和GI. 1/GII. 4 聯(lián)合疫 苗，其1b 期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示該二價(jià)疫 苗具有良好的耐受性，在大多數(shù)接種者中誘導(dǎo)產(chǎn)生了強(qiáng) IgA 反應(yīng)，且互不干擾。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所借助重組腺病毒表達(dá)載體研發(fā)的 GII. 4單價(jià)疫 苗，可有效激發(fā)小鼠全身、黏膜和 Th1 / Th2 細(xì)胞免疫應(yīng)答。且先用重組腺病毒疫 苗免疫再用 VLPs 加強(qiáng)免疫的小鼠比先用 VLPs 免疫再用重組腺病毒疫 苗免疫或者只用 VLPs 多次重復(fù)免疫的小鼠產(chǎn)生的體液、黏膜和干擾素-γ反應(yīng)更強(qiáng)，提示調(diào)整不同形式疫 苗之間的組合免疫順序也是提高免疫效果的一個(gè)重要思路。

       查閱相關(guān)網(wǎng)站，目前，我國(guó)進(jìn)入臨床階段的NoV VLP疫 苗有2個(gè)，分別為蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司研制的重組諾如病毒雙價(jià)（GI. 1/GII. 4）疫 苗和安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司的四價(jià)重組諾如病毒疫 苗，目前均處于II 期臨床試驗(yàn)中。具體情況如下表所示。

       NoV疫 苗研發(fā)難度大，主要受制于 4 個(gè)方面的因素。其一是NoV有著極高的原漂變率，每?jī)扇昃蜁?huì)有一個(gè)新的流行優(yōu)勢(shì)毒株，不同流行株間交叉保護(hù)力弱。其二是常用的細(xì)胞株均不能感染或擴(kuò)增NoV，僅 B 細(xì)胞和腸道類器官細(xì)胞模型可以檢測(cè)到后代NoV的擴(kuò)增，但培養(yǎng)條件極為復(fù)雜且成本昂貴。其三是缺乏一個(gè)簡(jiǎn)便且標(biāo)準(zhǔn)化的動(dòng)物模型，可適用于所有人類NoV的感染及疫 苗的評(píng)價(jià)。其四是臨床受試者招募難度大，受試者易感性影響試驗(yàn)結(jié)果，免疫效果不突出。盡管NoV 疫 苗的研發(fā)面對(duì)的困難較多，但隨著分子檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步和體外感染模型的逐步完善，相信一定能夠研制出一種安全、有效且可持續(xù)的NoV疫 苗。

       參考資料

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       作者簡(jiǎn)介：小泥沙，食品科技工作者，現(xiàn)就職于國(guó)內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事營(yíng)養(yǎng)食品及功能性食品的開發(fā)與研究。