重組蛋白藥物的生產(chǎn)技術(shù)及其藥效延長(zhǎng)方法

       重組蛋白藥物是生物藥物中的核心產(chǎn)品，主要是通過(guò)基因工程菌來(lái)生產(chǎn)功能蛋白或其突變體，用于彌補(bǔ)體內(nèi)蛋白的缺失，從而對(duì)疾病的治療發(fā)揮關(guān)鍵作用。近年來(lái)，重組蛋白藥物在疾病治療中發(fā)揮作用越來(lái)越大，相關(guān)技術(shù)也發(fā)展迅速。重組蛋白藥物種類繁多，包括多肽藥物、基因工程藥物、重組蛋白疫 苗、抗體類藥物等。相較于傳統(tǒng)藥物，重組藥物活性、特異性均更高，且毒 性低，更加安全有效。目前，市場(chǎng)上重組蛋白藥物表現(xiàn)為胰島素、激素、人造血因子、尼妥珠單抗等，臨床應(yīng)用廣泛。重組蛋白藥物的整體產(chǎn)業(yè)鏈分為上、中、下游，其中上游是基于基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)的研發(fā)環(huán)節(jié)，中游為藥物及給藥系統(tǒng)生產(chǎn)制造，包括大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)、重組蛋白純化與質(zhì)控。

       1、重組蛋白藥物生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)

       目前在工業(yè)應(yīng)用中，涉及到多種重組表達(dá)系統(tǒng)，其中在生產(chǎn)重組蛋白藥物中，主要應(yīng)用大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物 CHO 細(xì)胞系 3 種表達(dá)系統(tǒng)。在3種表達(dá)系統(tǒng)中，大腸桿菌系統(tǒng)最為簡(jiǎn)單。此系統(tǒng)涵蓋多種類型的菌株，這些菌株的主要差異在于篩選標(biāo)記、誘導(dǎo)方式、有無(wú)信號(hào)序列、營(yíng)養(yǎng)缺陷型及特殊蛋白質(zhì)折疊機(jī)制。對(duì)于大腸桿菌的基因工程改造更好地完善了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，如編碼二硫鍵異構(gòu)酶的基因已穩(wěn)定整合到大腸桿菌的基因組中，確保蛋白正確折疊，提高胞內(nèi)蛋白的折疊和溶解性。重組蛋白在大腸桿菌周質(zhì)空間中的有效分泌可提高大腸桿菌表達(dá)的蛋白可溶性。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)主要用于多肽類藥物的生產(chǎn)，如重組人胰島素和重組甲狀旁腺激素等。

       酵母系統(tǒng)主要包括釀酒酵母和畢赤酵母，此外還包括一些非傳統(tǒng)的酵母種類，如漢森菌多形酵母、脂酵母、裂殖酵母和乳酸克魯維酵母菌也已發(fā)展為合成各種不同特性蛋白藥物的宿主。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是廣泛研究的酵母表達(dá)系統(tǒng)之一，用于生物制藥合成的宿主。糖基化是重要的翻譯后修飾之一，盡管酵母可以進(jìn)行N?糖基化和O?糖基化，但與人源細(xì)胞的糖基化模式有顯著差異，其分泌的重組蛋白會(huì)形成α?1，3?甘露糖化，導(dǎo)致蛋白免疫原性增加、半衰期縮短。通過(guò)在酵母中準(zhǔn)確引入人源糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶，刪除超甘露糖化基因，可以使酵母糖基化途徑與人糖基化途徑相似，從而保證治療蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)特性。畢赤酵母（Pichia pastoris）生長(zhǎng)快，發(fā)酵細(xì)胞濃度高，可產(chǎn)生大量重組人源蛋白。畢赤酵母系統(tǒng)能夠靈活地選擇合適的載體和兼容宿主，高效、經(jīng)濟(jì)地表達(dá)重組蛋白，保證產(chǎn)品成功開(kāi)發(fā)。

       CHO 細(xì)胞系是一種來(lái)源于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢的上皮細(xì)胞系，能夠產(chǎn)生人同源性蛋白。人體組織纖溶酶原激活劑是1986 年第一個(gè)在 CHO 細(xì)胞系中成功生產(chǎn)并批準(zhǔn)臨床使用的重組治療蛋白。隨后，越來(lái)越多的治療性蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被制造出來(lái)，并且隨著工藝的優(yōu)化，在該表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)重組蛋白的技術(shù)得到了迅速發(fā)展。

       在廣泛篩選表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，蛋白的高表達(dá)量、翻譯后修飾質(zhì)量和遺傳穩(wěn)定性是主要的標(biāo)準(zhǔn)。不同的表達(dá)系統(tǒng)具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，需要根據(jù)產(chǎn)品的特性選擇合適的系統(tǒng)和宿主。優(yōu)勢(shì)宿主的篩選是生產(chǎn)異源蛋白的關(guān)鍵步驟。在選擇優(yōu)勢(shì)宿主時(shí)，通常采用高通量篩選技術(shù)，這種技術(shù)的出現(xiàn)徹底改變了宿主篩選技術(shù)領(lǐng)域，通過(guò)使用 96 深孔板或類似技術(shù)對(duì)多個(gè)批次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行平行篩選，提高了宿主的篩選效率。最終選擇的宿主要在產(chǎn)品質(zhì)量、滴度、特定生產(chǎn)率、工藝可行性、預(yù)期的電荷變體和糖基化配置、沒(méi)有或較少的聚集形成和克隆穩(wěn)定性上滿足標(biāo)準(zhǔn)。

       2、細(xì)胞培養(yǎng)

       在選擇好最 佳宿主后，下一個(gè)重要環(huán)節(jié)是細(xì)胞培養(yǎng)的開(kāi)發(fā)。為了更好的控制和優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程，開(kāi)發(fā)了各種新的技術(shù)和工具。通常，在宿主發(fā)酵生產(chǎn)蛋白藥物時(shí)，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基、溫度、pH、接種量和生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)等參數(shù)來(lái)提高蛋白質(zhì)的合成。生物量增長(zhǎng)率是促進(jìn)產(chǎn)品合成的關(guān)鍵因素，對(duì)于補(bǔ)料分批生產(chǎn)技術(shù)至關(guān)重要，某些醫(yī)藥公司將宿主細(xì)胞增長(zhǎng)率保持在小于最大增長(zhǎng)率的特定值，通過(guò)補(bǔ)料來(lái)控制宿主細(xì)胞以特定增長(zhǎng)率生長(zhǎng)。不過(guò)，近年來(lái)制藥行業(yè)越來(lái)越關(guān)注通過(guò)將分批生產(chǎn)轉(zhuǎn)變到連續(xù)生產(chǎn)來(lái)提高生物合成效率。

       在發(fā)酵工具上，使用自動(dòng)化控制的一次性生物反應(yīng)器系統(tǒng)是當(dāng)今生物制藥公司的一個(gè)新趨勢(shì)。與傳統(tǒng)的不銹鋼系統(tǒng)相比，一次性系統(tǒng)投資成本和操作成本更低，生產(chǎn)周期更短，靈活性更好，大大減少了污染的幾率。這些一次性生物反應(yīng)器及其附件可從50L擴(kuò)大到2000 L的規(guī)模。從細(xì)胞工程到細(xì)胞培養(yǎng)方法的創(chuàng)新開(kāi)發(fā)，使得單克隆抗體的產(chǎn)量從50 mg·L-1提高到5~20 g·L-1。

       3、重組蛋白藥物分離純化

       通過(guò)優(yōu)化好的細(xì)胞上游培養(yǎng)工藝，特定的表達(dá)系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生大量的重組藥物蛋白，其中還包含一些宿主本身的蛋白、核酸等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)可能對(duì)人體產(chǎn)生不利的生物活性。因此，對(duì)藥品的純度要求非常嚴(yán)格，這就需要對(duì)產(chǎn)品蛋白進(jìn)行精度純化。此環(huán)節(jié)是重組藥物蛋白制備技術(shù)的關(guān)鍵，是決定蛋白藥物品質(zhì)的核心。單克隆抗體或任何其他蛋白（包括重組酶）一般是通過(guò)各種過(guò)濾步驟和色譜層析等技術(shù)進(jìn)行純化的。色譜法是純化有價(jià)值產(chǎn)品最合適的技術(shù)，許多成熟的色譜方法已經(jīng)應(yīng)用到實(shí)際的生物制藥生產(chǎn)中。

       細(xì)胞培養(yǎng)完成后，離心、大孔徑切向流過(guò)濾和深度過(guò)濾是用于初級(jí)細(xì)胞澄清的常用技術(shù)，深度過(guò)濾和生物減重過(guò)濾器有助于二次澄清過(guò)程。不同的表達(dá)系統(tǒng)可能會(huì)有不同的分泌部位，導(dǎo)致收集方式不同。如在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白通常以包涵體的形式積累，需要回收后在體外重新折疊這些蛋白質(zhì)，使其具有生物活性。

       由于蛋白藥物混合物中含有大量不同化學(xué)性質(zhì)的雜質(zhì)，單一的色譜技術(shù)往往不足以獲得良好的分離。傳統(tǒng)的重組蛋白藥物純化工藝，是在收獲澄清后進(jìn)行超濾濃縮，隨后進(jìn)行逐級(jí)的單柱色譜分離純化，在充分了解目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)的理化性質(zhì)后，盡量減少純化步驟，一般分離純化不超過(guò)4步。隨著技術(shù)的發(fā)展，一種創(chuàng)新的固定相被開(kāi)發(fā)出來(lái)，其結(jié)合了兩種分離機(jī)制（反相或HILIC和離子交換），形成一種混合模式的純化方式。考慮到蛋白藥物混合物通常需要結(jié)合基于多種不同分離原理的色譜技術(shù)來(lái)提高分辨率，從而產(chǎn)生多維色譜分離技術(shù)。在線多維色譜中，從第一根色譜柱流出的產(chǎn)物會(huì)立即注入第二根色譜柱，并加快分析時(shí)間。通常，在分離過(guò)程中，質(zhì)譜與多維色譜聯(lián)用可提高純度。

       近年來(lái)，為了處理復(fù)雜生物分子混合物的純化，又開(kāi)發(fā)了一種稱為多柱逆流溶劑梯度純化（MCSGP）技術(shù)。MCSGP技術(shù)的原理是流動(dòng)相相對(duì)于固定相逆流運(yùn)動(dòng)，通過(guò)一系列切換閥進(jìn)行模擬，使整個(gè)過(guò)程實(shí)現(xiàn)循環(huán)和自動(dòng)化。使用MCSGP 技術(shù)可以使目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)之間的重疊峰在內(nèi)部循環(huán)，以便再加工，并且可以使用溶劑梯度進(jìn)行洗脫。這種技術(shù)已被用于多個(gè)需要加強(qiáng)純化的案例中，如單克隆抗體、寡核苷酸、大 麻二酚和多肽的純化。

       4、重組蛋白藥物的藥效延長(zhǎng)方法

       重組蛋白藥物相較于一般藥物具有特殊性，目前，提高重組蛋白藥物效果的研究方法主要基于如下3 種原理產(chǎn)生，第一，提高藥物蛋白分子量，降低腎小球過(guò)濾；第二，借助游離型或者結(jié)合型藥物，維持血漿平衡，減緩藥物釋放；第三，降低異源蛋白免疫原，以有效降低藥物釋放率?；谝陨? 種原理出現(xiàn)了以下延長(zhǎng)藥效的方法。

       ①構(gòu)建突變體：采用構(gòu)建突變體延長(zhǎng)藥物半衰期的方法主要如下：第一，提升藥物糖基化度，以此增加藥物表面?zhèn)孺?，提升蛋白質(zhì)平穩(wěn)度，防止蛋白酶快速降解藥物；第二，提高藥物分子量，避免腎小球過(guò)濾，延長(zhǎng)游離型藥物作用時(shí)間。基于上述兩種方法目前存在下述研究：第一，重組人促紅細(xì)胞生成素（EPO）存在1個(gè)O與3個(gè)N 糖基化位點(diǎn)。O是否糖基化與人體活性關(guān)系以及清除速度關(guān)系不大，但是N如果不完全重組則會(huì)影響人體活性，會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)活性降低。即是說(shuō)，N 糖基化更為重要，它能夠維持活性同時(shí)降低清除率。第二，研究基于大腸桿菌的K12株發(fā)現(xiàn)，基于人胰島素A-21位點(diǎn)下的反應(yīng)Asp 變?yōu)榱薌ly，在B-30位點(diǎn)下的反應(yīng)使得 PI-pH4.0變?yōu)榱藀H6.7。該突變能夠形成澄清溶液，進(jìn)入人體后鑒于其電解特點(diǎn)，可以轉(zhuǎn)化成難溶物質(zhì)，并持續(xù)釋放，溶于血液，長(zhǎng)時(shí)間保持平穩(wěn)，沒(méi)有尖峰，由原來(lái)的4-8h藥效延長(zhǎng)至24h以上，由每日3次的給藥變?yōu)槊咳?次。

       ②PEG 化修飾：聚乙二醇共價(jià)修飾蛋白質(zhì)即為 PEG 化修飾。采取提升蛋白質(zhì)分子量的方式降低藥效流失，將 PEG 作為屏障隔離蛋白質(zhì)分子表面反應(yīng)，降低免疫原性，降低藥物流失速度，同時(shí)保護(hù)蛋白質(zhì)不被水解。PEG 的上述作用可以大大提升藥物抗衰期時(shí)間。目前，存在兩代 PEG 修飾法，一是借助分子量不足 12kDa 的分子；二是借助分支PEG 替代 PEG，提升偶聯(lián)分子量，同時(shí)增加其數(shù)量，使其達(dá)到 60kDa。相較于一代，二代方法還能夠避免蛋白質(zhì)被酶水解，同時(shí)屏蔽效應(yīng)更大，同時(shí)降低清除率，是延長(zhǎng)藥效的有效方法。

       ③血清白蛋白融合：人體中的血清白蛋白，簡(jiǎn)稱 HSA，其內(nèi)含 585 氨基酸球形蛋白質(zhì)，分子量為 65kDa，屬于人體中高血漿含量蛋白質(zhì)。HSA 是諸多內(nèi)外源物質(zhì)載體，藥物與 HSA 結(jié)合后，能夠降低生物利用度，并在同一時(shí)間增加半衰期。臨床諸多治療蛋白藥物以及多肽藥效均較短，但是 HSA 理論上最長(zhǎng)能夠?qū)⑵涮嵘?19d，同時(shí)由于 HSA 基因還能夠高效表達(dá)，雜質(zhì)少，因此屬于延長(zhǎng)藥效的重要方法。

       目前，大量用于治療多種人類疾病的重組蛋白藥物，已獲批準(zhǔn)并上市。經(jīng)過(guò)幾十年的技術(shù)發(fā)展，我國(guó)重組蛋白藥物也取得了很大的進(jìn)步，尤其是近兩年新冠疫 苗的研發(fā)上。隨著分子和細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展，重組蛋白藥物的產(chǎn)量和質(zhì)量也有了很大的提高，加工周期大幅縮短。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，特別是 CRISPR/Cas9 等新型技術(shù)的應(yīng)用，載體工程取得新的突破，未來(lái)越來(lái)越多特定改造的細(xì)胞系將被用于重組蛋白藥物的生產(chǎn)。此外，進(jìn)一步提高國(guó)內(nèi)重組蛋白藥物的長(zhǎng)效性，推動(dòng)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的升級(jí)和創(chuàng)新，促進(jìn)長(zhǎng)效性蛋白藥物的開(kāi)發(fā)，也是我國(guó)生物醫(yī)藥的研究重點(diǎn)。

       參考資料

       [1]周娜娜,王小艷,張媛,王靖,趙國(guó)淼,魏超,楊凱,安泰.重組蛋白藥物的生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)展[J].生物技術(shù)進(jìn)展,2021,11(06):724-731.DOI:10.19586/j.2095-2341.2021.0130.

       [2]李學(xué)琴. 長(zhǎng)效重組蛋白藥物的研究進(jìn)展[J]. 健康之友,2020(14):291,290.

       作者簡(jiǎn)介：小泥沙，食品科技工作者，食品科學(xué)碩士，現(xiàn)就職于國(guó)內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事?tīng)I(yíng)養(yǎng)食品的開(kāi)發(fā)與研究。