高通量微型生物反應(yīng)器及其在生物制藥中的應(yīng)用

       隨著生物制藥行業(yè)的快速發(fā)展及競(jìng)爭(zhēng)加劇，縮短藥品開(kāi)發(fā)周期，開(kāi)發(fā)高效、穩(wěn)健和高質(zhì)量的生產(chǎn)工藝并降低生產(chǎn)成本顯得尤為迫切。目前大部分企業(yè)使用高通量技術(shù)、平臺(tái)工藝以及一次性生產(chǎn)技術(shù)等來(lái)加速產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。其中高通量技術(shù)可同時(shí)開(kāi)展多組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(DOE)，可縮短工藝開(kāi)發(fā)時(shí)間且能夠得到較好的實(shí)驗(yàn)效果。高通量微型反應(yīng)器的種類(lèi)繁多，早期的產(chǎn)品如微孔板、24深孔板，其體積量在微升級(jí)別，多用于原始克隆篩選，但是因無(wú)法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中重要參數(shù)監(jiān)控，導(dǎo)致使用范圍受限，并逐漸被淘汰。目前應(yīng)用廣泛的3種高通量微型生物反應(yīng)器分別是 Simcell、Ambr 15、Ambr 250，其培養(yǎng)體積規(guī)模各不相同，適用于不同的細(xì)胞培養(yǎng)工藝開(kāi)發(fā)階段。

       SimCell微型反應(yīng)器系統(tǒng)包括5個(gè)培養(yǎng)室，每個(gè)培養(yǎng)室含有42個(gè)卡式微型反應(yīng)器模塊，每個(gè)模塊有6個(gè)總體積<800μL獨(dú)立控制的微型反應(yīng)器(培養(yǎng)體積為300-700 μL) ，一臺(tái)SimCell系統(tǒng)理論上最多可同時(shí)運(yùn)行1260個(gè)微型反應(yīng)器。每個(gè)培養(yǎng)室可獨(dú)立控制溫度、相對(duì)濕度及通氣量，可在線測(cè)量細(xì)胞密度、pH及溶氧（DO）等參數(shù)。SimCell微型反應(yīng)器可用于克隆篩選及早期工藝優(yōu)化。SimCell系統(tǒng)的顯著優(yōu)勢(shì)為超高通量和超微體積，但小體積無(wú)法滿足常規(guī)離線分析需求，且無(wú)攪拌槳，不能很好地?cái)M合大規(guī)模反應(yīng)器。

       Ambr 系統(tǒng)由一次性反應(yīng)器罐體、自動(dòng)化工作站及操作軟件3部分組成，包括Ambr 15 和 Ambr 250。Ambr 系統(tǒng)具有高通量、自動(dòng)化及體積小等優(yōu)勢(shì)，且罐體幾何學(xué)設(shè)計(jì)如高徑比、槳葉設(shè)計(jì)等均與經(jīng)典攪拌反應(yīng)器類(lèi)似，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和控制工藝過(guò)程中的各個(gè)參數(shù)，具有良好的平行性與放大性。Ambr 系統(tǒng)軟件具備較高效的數(shù)據(jù)記錄、管理和分析能力，可以在工藝開(kāi)發(fā)和晚期臨床階段執(zhí)行 DOE 和數(shù)據(jù)分析。目前 Ambr 系統(tǒng)在生物制藥行業(yè)中得到了較為廣泛的應(yīng)用。Ambr 15工作體積為10～15mL，一次可運(yùn)行24～48個(gè)生物反應(yīng)器，具有攪拌槳和獨(dú)立通氣管路。除溫度和轉(zhuǎn)速由工作站統(tǒng)一控制外，其他參數(shù)如pH 及 DO 均可獨(dú)立控制?；诟叨茸詣?dòng)化的機(jī)械臂，Ambr 15 系統(tǒng)可自動(dòng)完成取樣及補(bǔ)液操作。由于Ambr 15 系統(tǒng)培養(yǎng)體積較小，限制了培養(yǎng)過(guò)程中的取樣頻率和收獲體積，無(wú)法為下游純化及制劑分析提供足夠多的樣品。此外，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中取樣、補(bǔ)料及補(bǔ)堿等操作可能會(huì)引起Ambr 15系統(tǒng)在線 DO、pH及溫度的波動(dòng)。

       Ambr250是Ambr 15 的升級(jí)產(chǎn)品，能獨(dú)立運(yùn)行12～24個(gè)一次性生物反應(yīng)器，工作體積為100-250mL，可滿足后續(xù)純化和樣品分析需求，可獨(dú)立控制溫度和轉(zhuǎn)速，有4條補(bǔ)料管路連接每個(gè)反應(yīng)器，可實(shí)現(xiàn)分批補(bǔ)料(10μL～10mL) 或連續(xù)流加，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)和微生物發(fā)酵不同工藝的需求。Ambr 250一次性反應(yīng)器含有雙層斜三葉槳，嵌合4個(gè)擋板以促進(jìn)液體混合，與傳統(tǒng)生物反應(yīng)器有類(lèi)似的幾何尺寸及流體力學(xué)性質(zhì)，從而保證 Ambr 250細(xì)胞培養(yǎng)的微環(huán)境在一定程度上與傳統(tǒng)反應(yīng)器更接近，工藝容易放大。

       近年來(lái)，高通量微型生物反應(yīng)器已在生物制藥行業(yè)得到廣泛應(yīng)用，可應(yīng)用于細(xì)胞株篩選、培養(yǎng)基與工藝開(kāi)發(fā)及工藝表征等各個(gè)階段。

       1、克隆篩選與培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)

       細(xì)胞株篩選要先把目的基因整合到基因組中，而這個(gè)過(guò)程是隨機(jī)的，因此，轉(zhuǎn)染后的每個(gè)細(xì)胞表現(xiàn)各異，需進(jìn)行大量克隆篩選以得到最終的高產(chǎn)穩(wěn)定細(xì)胞株。一般使用微孔板等進(jìn)行早期高通量克隆篩選，然后在24深孔板、搖管或搖瓶中補(bǔ)料分批培養(yǎng)進(jìn)行進(jìn)一步篩選。從24深孔板、搖管或搖瓶中篩選得到的表現(xiàn)較好的細(xì)胞株在放大至反應(yīng)器時(shí)會(huì)出現(xiàn)不一致情況，這是由于部分高表達(dá)克隆不具備可放大性，另外這些培養(yǎng)容器不能監(jiān)控pH 與 DO 等關(guān)鍵參數(shù)，培養(yǎng)微環(huán)境與臺(tái)式反應(yīng)器相差甚遠(yuǎn)，不能很好地預(yù)測(cè)高產(chǎn)克隆在反應(yīng)器規(guī)模上的表現(xiàn)。傳統(tǒng)反應(yīng)器由于通量低且運(yùn)行成本高，評(píng)估的克隆數(shù)量有限，也不是理想的克隆篩選工具。為降低細(xì)胞株在工藝放大時(shí)出現(xiàn)異常風(fēng)險(xiǎn)，可使用高通量 Ambr 系統(tǒng)進(jìn)行篩選評(píng)估，其具有較好的預(yù)測(cè)性和可放大性，是高效可靠的克隆篩選工具。此外，可通過(guò)整合的克隆篩選軟件進(jìn)行克隆篩選排序評(píng)分，為候選克隆的選擇提供指導(dǎo)。此外，培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)是提高產(chǎn)量、質(zhì)量及降低生產(chǎn)成本的關(guān)鍵手段之一。高通量細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備可用于培養(yǎng)基的高通量快速篩選，優(yōu)化培養(yǎng)基的關(guān)鍵組分。

       2、工藝開(kāi)發(fā)

       使用Ambr 15 反應(yīng)器同步運(yùn)行24個(gè)實(shí)驗(yàn)條件考察接種密度、pH及 DO 等3個(gè)關(guān)鍵工藝參數(shù)，結(jié)果顯示相同條件下的反應(yīng)器在細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝以及蛋白表達(dá)方面表現(xiàn)具有高度一致性，不同條件下的反應(yīng)器則有明顯區(qū)別，大大提高了工藝優(yōu)化的效率。分別在搖瓶和Ambr 15 反應(yīng)器中測(cè)試一種新開(kāi)發(fā)的培養(yǎng)基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ambr 15 反應(yīng)器中的細(xì)胞活率和蛋白產(chǎn)量相比于搖瓶均有明顯下降。經(jīng)過(guò)分析，Ambr 15反應(yīng)器中蛋白產(chǎn)量和細(xì)胞活率的下降可能是由于乳酸濃度增加引起的。為了研究Ambr 15 反應(yīng)器中乳酸濃度升高的原因，考察了轉(zhuǎn)速、通氣和pH 對(duì)乳酸積累的影響。結(jié)果顯示，通氣和pH 控制策略對(duì)乳酸積累有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的影響，其中pH 影響顯著。使用優(yōu)化后的條件在Ambr 15 中運(yùn)行，達(dá)到了與搖瓶培養(yǎng)一致的細(xì)胞活率和表達(dá)水平。高通量微型生物反應(yīng)器中進(jìn)行的工藝優(yōu)化需放大至生產(chǎn)規(guī)模反應(yīng)器中，因此評(píng)價(jià)設(shè)備和工藝的可放大性也尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，將在Ambr 15 中開(kāi)發(fā)的細(xì)胞培養(yǎng)工藝分別放大至2L反應(yīng)器和80L，400L Zeta 不銹鋼生物反應(yīng)器，結(jié)果顯示 Ambr15 與不同規(guī)模的反應(yīng)器在細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、蛋白表達(dá)及產(chǎn)品質(zhì)量屬性上均比較一致。這一結(jié)果顯示Ambr 15 反應(yīng)器具備較好的可放大性。

       3、工藝表征

       細(xì)胞培養(yǎng)工藝表征的目的是研究關(guān)鍵操作參數(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)關(guān)鍵性能指標(biāo)如細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)品表達(dá)及最終產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性等之間的關(guān)系，來(lái)確定各關(guān)鍵操作參數(shù)的可接受范圍，并證明工藝的穩(wěn)健性。傳統(tǒng)上，一般使用1~10L規(guī)模的臺(tái)式反應(yīng)器進(jìn)行大量的 DOE 實(shí)驗(yàn)以評(píng)估各個(gè)參數(shù)的主效應(yīng)及交互作用影響，這需要投入大量的時(shí)間、人力和資源。高通量 Ambr 系統(tǒng)作為縮小模型進(jìn)行工藝開(kāi)發(fā)和工藝表征已有不少研究。

       Ambr 系統(tǒng)可作為高效的縮小模型應(yīng)用于工藝開(kāi)發(fā)與工藝表征，能顯著加快工藝開(kāi)發(fā)和工藝表征過(guò)程。不過(guò) Ambr 系統(tǒng)作為商業(yè)化生產(chǎn)工藝的縮小模型來(lái)進(jìn)行工藝表征仍面臨一些挑戰(zhàn)。首先，縮小模型標(biāo)準(zhǔn)在 Ambr 和大規(guī)模生物反應(yīng)器間是不可比的，需要對(duì) Ambr 系統(tǒng)進(jìn)行更詳細(xì)更有針對(duì)性的表征研究，并采用新的縮小模型策略。其次，需要采用更合適的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及統(tǒng)計(jì)分析軟件來(lái)解決高通量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析的瓶頸。最后，需要認(rèn)識(shí)到并非所有的工藝都可利用 Ambr 系統(tǒng)建立縮小模型，要充分了解設(shè)備的限制以及相關(guān)的關(guān)鍵操作參數(shù)及關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

       高通量微型生物反應(yīng)器系統(tǒng)在早期工藝開(kāi)發(fā)階段可使用 DOE 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行高通量工藝研究，縮短工藝開(kāi)發(fā)時(shí)間并降低人力物力成本，加速晚期臨床階段工藝優(yōu)化與工藝表征，推進(jìn)生物藥物的快速發(fā)展。高通量微型反應(yīng)器具有操作簡(jiǎn)單、通量高、成本縮減等優(yōu)勢(shì)，能夠較大程度提升工藝開(kāi)發(fā)的效率，降低研發(fā)成本和縮短研發(fā)周期。同時(shí)，這類(lèi)反應(yīng)器可有效結(jié)合DOE 設(shè)計(jì)進(jìn)行工藝開(kāi)發(fā)，提高工藝穩(wěn)定性和工藝質(zhì)量可控性，這也使得高通量微型反應(yīng)器的應(yīng)用前景更為廣闊。

       參考文獻(xiàn)：

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       作者簡(jiǎn)介：小泥沙，食品科技工作者，食品科學(xué)碩士，現(xiàn)就職于國(guó)內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事?tīng)I(yíng)養(yǎng)食品的開(kāi)發(fā)與研究。