玻璃化冷凍技術(shù)及其研究進展

       對于生物制品，如**、免疫血清、免疫球蛋白、抗原及酶等，多以溶液形式生產(chǎn)，這些昂貴的產(chǎn)品在常溫條件下極易發(fā)生蛋白質(zhì)的快速降解導(dǎo)致活性降低。這些產(chǎn)品通常被冷藏儲存和運輸，對冷鏈的依賴使這些產(chǎn)品更加昂貴。

       目前延長生物制品保存期限的方法主要有以下幾種，（1）快速分析核酸技術(shù)（FTA）：FTA卡片是經(jīng)化學(xué)試劑特殊處理的棉纖維卡片，通過干式化學(xué)穩(wěn)定基質(zhì)保存生物樣本中的核酸。但FTA卡片只能用于常溫下保存樣品中的核酸，且DNA和RNA只能保存一種，卡片亦不適用于保存及分析生物材料中其他成分比如酶和其他蛋白。（2）福爾馬林固定石蠟包埋技術(shù)：該技術(shù)可將組織在常溫條件下保存較長時間，但處理過程中固定液的交聯(lián)作用使得DNA受損傷，出現(xiàn)片段化，并且固定和包埋的操作也會導(dǎo)致RNA和蛋白質(zhì)的質(zhì)量下降。（3）真空冷凍干燥技術(shù)：該技術(shù)是將含有水的生物樣品預(yù)先冷凍成固態(tài)，再在低溫低壓條件下進行水的升華作用，最后生物樣品低溫脫水而達到干燥的技術(shù)，然而整個凍干過程中生物樣品需承受各種各樣的應(yīng)力，這些應(yīng)力常常直接或間接導(dǎo)致蛋白不穩(wěn)定。為了克服以上這些技術(shù)的缺點，玻璃化冷凍技術(shù)應(yīng)運而生，并且在生物樣本的常溫穩(wěn)定保存方面表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢。

       1.玻璃化冷凍技術(shù)的特點

       玻璃化冷凍技術(shù)是將物質(zhì)轉(zhuǎn)變成玻璃樣無定形體的技術(shù)。玻璃化是液態(tài)物質(zhì)在一定的降溫速率下由液相直接傳變?yōu)椴ＡЩ墓腆w狀態(tài)的過程，期間沒有晶體結(jié)構(gòu)的生成，也能夠保持液相時期的分子以及離子的分布，在冷凍和解凍的過程里也不會在液態(tài)和晶體之間來回的變化，這時所表現(xiàn)出的力學(xué)性質(zhì)與玻璃相似，故稱這種狀態(tài)為玻璃態(tài)，是一種介于液態(tài)與固態(tài)之間的狀態(tài)。

       液體在冷凍過程中以何種狀態(tài)固化，取決于液體黏滯系數(shù)、降溫速率及液體總體積。從理論上講，只要獲得足夠的降溫速度，任何液體都可以進入玻璃態(tài)。實現(xiàn)玻璃化需要足夠快的冷卻速度，當溫度下降，勢壘足夠大，此時分子構(gòu)象被凍結(jié)，與環(huán)境之間由擴散控制的物質(zhì)交換及化學(xué)反應(yīng)在動力學(xué)上受阻，而蛋白質(zhì)大多數(shù)降解途徑是由于分子的運動性，因此玻璃化體系具有良好的結(jié)構(gòu)和化學(xué)穩(wěn)定性。發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變時所對應(yīng)的溫度稱之為玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）。保持制品的玻璃態(tài)需儲存在低于或等于該物質(zhì)的Tg，若制品的Tg高于室溫，則有希望實現(xiàn)室溫下較長時間的穩(wěn)定保存。玻璃化冷凍技術(shù)只需達到較高的降溫速度即可，無特定儀器的需求，比如可直接投入液氮，節(jié)約了成本，玻璃化冷凍技術(shù)還有操作步驟簡便、儲存穩(wěn)定性好、復(fù)蘇率高等優(yōu)勢。此外，在低**的保護劑濃度和較高降溫速度的前提下優(yōu)化玻璃化制品的Tg，可實現(xiàn)制品的常溫儲存，這對于玻璃化冷凍技術(shù)的進一步發(fā)展和應(yīng)用具有重要意義。

       2.玻璃化冷凍技術(shù)影響因素

       2.1冷凍保護劑（CPA）

       玻璃化過程中包含快速降溫步驟，一般需添加CPA。對一般制品來說，其能夠保持玻璃化過程中制品結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，對細胞來說，其能夠防止胞內(nèi)水結(jié)晶，避免應(yīng)力損傷細胞膜。主要分為滲透性保護劑和非滲透性保護劑。

       滲透性冷凍保護劑主要包括乙二醇、丙二醇、二甲基亞砜、丙三醇等，它們水溶性較強，可以較為快速的進入細胞內(nèi)，抑制細胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生，但對細胞有不同程度的**作用。非滲透性保護劑主要為蔗糖、葡聚糖、海藻糖、聚乙烯毗咯烷酮、抗壞血酸等，不能滲透入細胞膜內(nèi)，只能起到提高細胞外滲透壓的作用。

       2.2降溫速率

       玻璃化過程中的降溫速率是影響玻璃化效果的重要因素。玻璃化制品中液體在熔點（Tm）以下的溫度時為過冷態(tài)，當降溫速度較慢以至于系統(tǒng)可以保持在準熱平衡態(tài)，那么玻璃化制品就可能在Tm處發(fā)生晶化以致不能達到玻璃態(tài)。

       2.3其他因素

       制品的體積及冷凍載體也影響玻璃化制品的降溫速率。越小的冷凍容量，獲得的冷凍效果越好，開放性載體如開放式麥管、EP管等，制品與液氮直接接觸，能夠?qū)崿F(xiàn)更高的降溫速率，但有易污染、保存數(shù)量少、成本高等缺點。封閉式載體如拉細麥管、冷凍鉤等，可避免污染，但延長了體系在冷凍液中的時間，對操作要求很高。樣品本身含水量也會對玻璃化過程產(chǎn)生影響。一般制品水分含量每增加1%，其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度會下降5～10℃。

       3.玻璃化冷凍技術(shù)的應(yīng)用

       3.1蛋白類藥物

       基于蛋白質(zhì)的生物藥物，如多肽、單克隆抗體和基因工程抗體、重組**，多嚴格按照冷鏈儲存。玻璃化冷凍技術(shù)可作為理化性質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)藥物制劑的有效制備方法，延長藥品的貯存時間，尤其對于熱敏性蛋白藥物，如昂貴的新型**肺炎球菌結(jié)合物，輪狀病毒和HPV**等，能夠?qū)崿F(xiàn)非冷鏈條件下穩(wěn)定儲存的目的。研究通過用海藻糖和明膠等生產(chǎn)了減毒活沙門氏菌Ty21a細菌**玻璃體制劑，在37℃時能夠穩(wěn)定貯存約3月。

       3.2生物酶

       市面上商品化的生物酶一般與甘油按一定比例混合后在低溫條件下保存，而玻璃化冷凍技術(shù)在生物酶的應(yīng)用上，亦改善了生物酶制品的存放環(huán)境條件。采Ficoll400和松三糖制得了玻璃化的限制性內(nèi)切酶能夠在室溫或者37℃條件下穩(wěn)定存放4個月，玻璃化酶制品的應(yīng)用還可避免儲存或運輸過程中冷鏈斷裂帶來的假陰性結(jié)果，并且延長其活性穩(wěn)定的貯存時間。

       3.3細胞與胚胎、組織

       玻璃化冷凍技術(shù)在細胞與胚胎、組織中已應(yīng)用良多，采用玻璃化冷凍技術(shù)的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在顯著改善其復(fù)蘇率方面，并且開發(fā)出新的細胞、胚胎、組織和器官等的保存方法。在冷凍保護液中對人類受精卵進行玻璃化，20個受精卵在玻璃化過程中皆存活，18個受精卵在培養(yǎng)24h后恢復(fù)分裂。

       3.4食品

       食品在低于Tg時貯藏能最 大限度的保存食品質(zhì)量。在玻璃態(tài)下，由于分子運動的限制，造成食品品質(zhì)變化的一切受擴散控制的反應(yīng)均變得十分緩慢，甚至不會發(fā)生。此時食品的各方面性質(zhì)都很穩(wěn)定，對食品的貯藏和鮮度等品質(zhì)的維持非常有利。對帶魚制品進行玻璃化發(fā)現(xiàn)，添加保護液的帶魚制品各指標的下降速度均低于空白對照組，玻璃化魚肉可以抑制蛋白質(zhì)冷凍變性、保持蛋白質(zhì)原有結(jié)構(gòu)和功能，比普通貯藏的保鮮期延長了約20d。

       玻璃化冷凍技術(shù)的主要目的在于實現(xiàn)更長時間，更簡便條件的儲存，其憑借顯著的優(yōu)勢已經(jīng)廣泛應(yīng)用到諸多領(lǐng)域。玻璃化冷凍技術(shù)的未來發(fā)展空間在于Tg的提高，高的Tg不僅能夠提高貯存穩(wěn)定性，還可以實現(xiàn)產(chǎn)品的常溫條件下的儲存。影響玻璃化冷凍技術(shù)效果以及Tg的因素，主要是CPA的組成、進行玻璃化時的降溫速率、玻璃化載體的選擇，并且開發(fā)新的玻璃化載體也是未來研究的方向。對于生物藥物，雖說玻璃化態(tài)在非冷鏈下存放已實現(xiàn)，甚至能保持數(shù)月，但還需要大規(guī)模重復(fù)安全性和免疫原性研究以獲得玻璃化改進的批準，所以現(xiàn)有生物藥物到玻璃化狀態(tài)的發(fā)展還需時日。

       參考文獻：

       [1]邢思熙,梁碩,徐曉筱,鄒秉杰,宋沁馨,周國華.玻璃化技術(shù)及其應(yīng)用研究進展[J].藥物生物技術(shù),2021,28(03):284-290.DOI:10.19526/j.cnki.1005-8915.20210313.

       [2]徐利,葛鳳菊,黃亞.玻璃化冷凍技術(shù)的應(yīng)用及研究進展[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展,2018,27(01):75-78.DOI:10.13283/j.cnki.xdfckjz.2018.01.019.

       作者簡介：沙羅，中藥研發(fā)工作者，現(xiàn)就職于國內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，致力于中藥新藥的研究開發(fā)。