小分子抗新冠藥物的突破性研究進(jìn)展

       席卷全球的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19, 簡(jiǎn)稱新冠肺炎)由一種新型單鏈RNA冠狀病毒引起，國(guó)際病毒分類學(xué)委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)將該病毒命名為SARS-CoV-2。SARS-CoV-2 的生命周期主要包括病毒附著、膜融合、基因組復(fù)制、病毒粒子組裝和釋放。當(dāng)前，針對(duì) SARS-CoV-2 的藥物研發(fā)主要以病毒生命周期中的一個(gè)或多個(gè)事件為靶標(biāo)來(lái)阻止病毒復(fù)制，如阻斷刺突蛋白與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 2（ACE2）結(jié)合和抑制病毒膜與宿主細(xì)胞融合或抑制3CL 蛋白酶（3C-likeprotease, 3CLpro）和木瓜蛋白酶（PLpro）或抑制依賴 RNA 的 RNA 聚合酶（RdRp）等。現(xiàn)階段針對(duì) SARS-CoV-2 的口服小分子藥物已取得突破性進(jìn)展，多種治療藥物已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)。

       RNA聚合酶（RdRp）抑制劑

       1、莫努匹韋（ molnupiravir）

       莫努匹韋(molnupiravir, MK-4482, EIDD-2801)是2021年11月4日英國(guó)藥品與健康產(chǎn)品管理局(Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency, MHRA)批準(zhǔn)上市的第一款用于成年人輕度至中度新冠感染治療的RdRp口服抑制劑藥物。莫努匹韋在整個(gè)臨床試驗(yàn)(Ⅰ~Ⅲ期：NCT04392219、NCT04405570、NCT04405739、NCT04939428、NCT04575597、NCT04575584)中均表現(xiàn)出針對(duì)新冠肺炎患者較理想的治療效果和安全性。莫努匹韋在SARS-CoV-2感染的Vero細(xì)胞中的抗病毒 藥效約為EC50=0.3 μmol/L，在人呼吸道上皮細(xì)胞中抗病毒復(fù)制的藥效為EC50=0.14 μmol/L。體外**數(shù)據(jù)顯示，針對(duì)Vero細(xì)胞的CC50>10 μmol/L，**與藥效的安全窗口較為理想，因此莫努匹韋被選定為臨床候選化合物。科學(xué)家在藥效機(jī)理研究中發(fā)現(xiàn)，莫努匹韋能有效插入SARS-CoV-2病毒的RNA模，促進(jìn)病毒的突變和復(fù)制終結(jié)。細(xì)胞培養(yǎng)中的臨床前數(shù)據(jù)顯示，發(fā)生G到A和C到U轉(zhuǎn)換突變的病毒RNA數(shù)量在莫努匹韋作用下劑量依賴性增加，這與莫努匹韋的抗冠狀病毒 藥效成正相關(guān)。因此，莫努匹韋被歸類為誘變核苷酸類似物?？蒲腥藛T用SARS-CoV-2純化的RdRp蛋白酶結(jié)合病毒RNA復(fù)制測(cè)試評(píng)價(jià)，研究了藥物潛在的生化機(jī)制，即莫努匹韋作為前藥在血漿中代謝為N 4-羥基胞苷(EIDD-1931)，該活性主體分子進(jìn)入宿主被感染細(xì)胞后，經(jīng)激酶磷酸化形成N-羥基胞苷三磷酸作為藥物活性成分，參與病毒RNA復(fù)制過(guò)程并誘導(dǎo)RNA復(fù)制突變體的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致病毒復(fù)制終止。

       2021年3月默克公司(Merck)的Ⅱ期臨床結(jié)果顯示，從第5天接受該藥治療的新冠肺炎患者，在所有劑量組均達(dá)到了病毒陽(yáng)性檢出率為0%(安慰劑組為24%)的效果。最新的Ⅲ期臨床結(jié)果顯示，莫努匹韋受試者在死亡和住院風(fēng)險(xiǎn)兩項(xiàng)指標(biāo)中均降低了50%. 接受莫努匹韋治療的患者在隨機(jī)分組后的第29天住院或死亡的概率為7.3%，而安慰劑治療的患者為14.1%。在安全性方面，莫努匹韋治療組因藥物相關(guān)不良事件而終止治療的受試者約為1.3%，治療組和安慰劑組發(fā)生任何級(jí)別不良反應(yīng)的比率分別為35%和40%。

       2、瑞德西韋（ remdesivir）

       瑞德西韋(remdesivir, GS-5734)是美國(guó)吉利德科學(xué)公司的一款在研核苷類似物前藥，可以從核糖衍生物經(jīng)由多步反應(yīng)合成獲得，為一種核苷類似物的前體藥物，通過(guò)RdRp 有效地結(jié)合到新生 RNA 鏈中，從而導(dǎo)致病毒復(fù)制提前終止。對(duì)絲狀病毒和冠狀病毒等多種病毒科病毒具有廣譜抗病毒活性，半最 大效應(yīng)濃度（EC50）值范圍為0.0035～0.75 μmol/L-1。體外試驗(yàn)已證實(shí)瑞德西韋對(duì) SARS-CoV-2 的有效抗病毒活性。瑞德西韋通過(guò)靜脈給藥，30～120 min 輸注，其在血漿中很容易檢測(cè)到，并在輸注結(jié)束時(shí)達(dá)到峰值濃度，隨后迅速消失（中位時(shí)間 0.5～1 h）。在體外試驗(yàn)中，瑞德西韋可以抑制SARS-CoV-2(在Vero E6細(xì)胞中的EC50=0.77 μmol/L)。但是針對(duì)該藥物有效性的臨床研究產(chǎn)生了前后矛盾的結(jié)果?；谧赃m應(yīng)性COVID-19治療試驗(yàn)(adaptive clinical design)的結(jié)果，美國(guó)FDA已經(jīng)批準(zhǔn)該藥物治療COVID-19住院患者。而世界衛(wèi)生組織基于“團(tuán)結(jié)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(solidarity clinical trial)”則認(rèn)為，該藥物在提高患者生存率或降低患者對(duì)吸氧的需求等方面沒(méi)有產(chǎn)生有意義的影響。

       瑞德西韋是被批準(zhǔn)用于治療 COVID-19 的第一個(gè)藥物，已在日本、澳大利亞、韓國(guó)、加拿大、以色列等全球多個(gè)國(guó)家注冊(cè)批準(zhǔn)用于治療 COVID-19 患者。根據(jù)藥物作用機(jī)制及目前已有研究結(jié)果表明，瑞德西韋對(duì)重型/危重型患者效果差，臨床治療時(shí)應(yīng)盡早、及時(shí)應(yīng)用。但其給藥方式的局限，限制了臨床早期用藥。

       3、法匹拉韋（ favipiravir）

       法匹拉韋(Favipiravir, T-705)被用于新發(fā)或復(fù)發(fā)流感的治療。工業(yè)上主要以3-氨基吡嗪-2-羧酸為原料，經(jīng)羥基化、酯化、氨解、硝化、還原、重氮化等反應(yīng)制得，收率較低，生產(chǎn)成本較高。法匹拉韋是一種前藥，作為一種鳥(niǎo)嘌呤類似物，在進(jìn)入受感染細(xì)胞后，通過(guò)模擬鳥(niǎo)苷三磷酸(GTP)嵌入延伸的RNA鏈中競(jìng)爭(zhēng)性抑制RdRp，從而抑制病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)抗RNA病毒(例如流感病毒、埃博拉病毒、黃熱病毒、奇昆古尼亞病毒、諾如病毒和腸病毒等)的作用。鑒于它對(duì)SARS-CoV-2也具有良好的體外抑制活性(在Vero E6細(xì)胞中EC50=61.88 μmol/L)，法匹拉韋于2020年5月率先在印度獲得了新冠肺炎治療的“緊急使用授權(quán)”，隨后俄羅斯衛(wèi)生監(jiān)管部門也賦予了該藥物針對(duì)新冠肺炎患者的緊急使用授權(quán)。法匹拉韋在日本已經(jīng)完成了針對(duì)新冠肺炎危重病人的Ⅲ期臨床試驗(yàn)，目前正處于“預(yù)注冊(cè)”階段。法匹拉韋在臨床階段的結(jié)果仍存在爭(zhēng)議，不過(guò)在預(yù)催化狀態(tài)下與SARS-CoV-2的RdRp復(fù)合物冷凍電子顯微鏡結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，該藥物除非在模板RNA中遇到重復(fù)的嘧啶殘基，否則RNA產(chǎn)物中法匹拉韋的存在不會(huì)立即終止生長(zhǎng)鏈的延伸，并且法匹拉韋能夠逃脫轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體(replication and transcription complex, RTC)的校對(duì)機(jī)制，導(dǎo)致后代病毒基因組發(fā)生突變，從而發(fā)揮抗病毒功效。這一發(fā)現(xiàn)解釋了該藥物在體外沒(méi)有顯著抑制RNA合成的現(xiàn)象。

       目前，日本、俄羅斯、沙特阿拉伯、泰國(guó)、肯尼亞等國(guó)已在指南中推薦輕度至中度 COVID-19 患者使用法維拉韋口服治療。值得注意的是，法維拉韋對(duì)有生殖需求、痛風(fēng)史和高尿酸的患者要謹(jǐn)慎使用，對(duì)于過(guò)敏、嚴(yán)重肝損害和腎損害的患者，禁用該藥。但結(jié)合藥物作用機(jī)制及多項(xiàng)臨床試驗(yàn)的樂(lè)觀研究結(jié)果，法維拉韋仍有望成為 SARS-CoV-2 抗病毒治療的新選擇。

       蛋白酶抑制劑

       1、3C樣胰凝乳蛋白酶（3CLpro）抑制劑

       3C樣胰凝乳蛋白酶(3C-like protease, 3CLpro,Mpro, nsp5)亦稱為M蛋白酶，是病毒復(fù)制過(guò)程必需的功能蛋白。該蛋白酶通過(guò)水解多聚蛋白pp1a、pp1ab中至少11個(gè)保守位點(diǎn)，以保證病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制關(guān)鍵非結(jié)構(gòu)蛋白nsp4~16的生成，其中包括RdRp、解旋酶以及Mpro自己，并且Mpro不同毒株之間具有高度同源性而與人類宿主細(xì)胞缺乏同源性。因此，M蛋白酶也被認(rèn)為是抗病毒 藥物開(kāi)發(fā)的重要靶點(diǎn)之一。

       美國(guó)輝瑞公司研究人員以SARS-CoV-2 Mpro為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)和篩選出了具有強(qiáng)效病毒抑制作用的臨床候選藥物PF-07321332。其在體外實(shí)驗(yàn)中針對(duì)SARS-CoV-2 Mpro的酶抑制常數(shù)Ki為3.11 nmol/L，酶抑制活性為IC50=18.0 nmol/L，而針對(duì)SARS-CoV-2病毒感染的抗病毒活性為EC50=74~93 nmol/L。PF-07321332在臨床前試驗(yàn)中具有比較低的口服生物利用度，在大鼠和犬的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中生物利用度保持在20%~25%，其原因在于PF-07321332本身是體內(nèi)藥物代謝酶CYP3A4的代謝底物。鑒于此，在臨床試驗(yàn)中采用了與CYP3A4強(qiáng)效抑制劑瑞托那韋(ritonavir)聯(lián)用的策略(NCT04756531)，以提高藥物在體內(nèi)的半衰期和生物利用度。藥物與SARS-CoV-2的晶體結(jié)構(gòu)顯示，藥物分子中的CN取代基以共價(jià)方式與蛋白酶中的Cys145殘基結(jié)合，但該共價(jià)結(jié)合模式在非可逆SARS-CoV-2抑制劑競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)是一種可逆模式。

       目前，已經(jīng)完成了PF-07321332針對(duì)輕度及中度癥狀新冠病毒感染者的Ⅲ期臨床試驗(yàn)研究。結(jié)果顯示，在1219名未接種新冠**的成年患者中，發(fā)熱、干咳等新冠肺炎癥狀出現(xiàn)后3 d內(nèi)服用本抑制劑的住院率從安慰劑組的7%降至0.8%，死亡率從1.8%降至0%。本藥物已于2021年11月申請(qǐng)美國(guó)FDA的緊急使用授權(quán)。

       2、木瓜樣蛋白酶（PLpro）抑制劑

       PLpro是剪切經(jīng)宿主細(xì)胞翻譯機(jī)制表達(dá)的多聚蛋白pp1a和pp1ab的兩個(gè)關(guān)鍵蛋白酶之一(PLpro負(fù)責(zé)切割nsp1、nsp2和nsp3)，可以高活性地切割Lys48連接的多聚泛素和泛素樣分子干擾素刺激基因15(ISG15)的修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。因此，當(dāng)PLpro被抑制后，理論上可以實(shí)現(xiàn)病毒載量的降低以及宿主先天免疫系統(tǒng)的恢復(fù)。因其在病毒復(fù)制和宿主細(xì)胞控制中的多重作用，PLpro被認(rèn)為是一個(gè)潛在的抗病毒靶點(diǎn)。

       GRL0617最初是在2003年SARS暴發(fā)時(shí)開(kāi)發(fā)的PLpro抑制劑。由于SARS-CoV-2的PLpro與SARS-CoV PLpro具有82%序列相似性和90%的結(jié)構(gòu)相似性，研究人員針對(duì)前期具有SARS-CoV抑制活性的化合物開(kāi)展了SARS-CoV-2抗病毒活性篩選。研究顯示，在SARS-CoV-2感染的Vero E6細(xì)胞中100 μmol/L的GRL0617能有效抑制SARS-CoV-2的胞內(nèi)復(fù)制，抑制率達(dá)50%以上。為了驗(yàn)證化合物的抗病毒復(fù)制作用與靶標(biāo)的相關(guān)性，對(duì)其進(jìn)行了體外細(xì)胞測(cè)試并獲得了該藥物與PLpro的共晶結(jié)構(gòu)。體外測(cè)試結(jié)果表明，該抑制劑針對(duì)SARS-CoV-2的PLpro蛋白酶具有較強(qiáng)的抑制活性(IC50=2.1 μmol/L)，并且在Vero E6細(xì)胞中該藥物濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)無(wú)明顯的細(xì)胞**。

       在當(dāng)前COVID-19全球大流行以及SARSCoV-2 持續(xù)變異的背景下，研發(fā)出有效、安全的抗病毒 藥物并廣泛推廣應(yīng)用是降低疾病全球負(fù)擔(dān)的重要舉措。小分子藥物具有易吸收、分子體積小、能夠穿透細(xì)胞膜、易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，預(yù)期未來(lái)這類藥物可在早期廣泛應(yīng)用，降低重癥化率、降低病死率以及為早日戰(zhàn)勝新型冠狀病毒做出重大貢獻(xiàn)。

       參考文獻(xiàn)：

       [1]趙喆,張清,葛子若,張偉,陳志海.小分子抗新型冠狀病毒 藥物的突破性進(jìn)展[J].中國(guó)藥物警戒,2022,19(01):1-6.DOI:10.19803/j.1672-8629.2022.01.01.

       [2]張儒,孫子茹,劉勝男,高清志.新型冠狀病毒治療藥物的研究現(xiàn)狀及展望[J/OL].科學(xué)通報(bào):1-15[2022-02-13].https://kns-cnki-net.wv p n.ncu.edu.cn/kcms/detail/11.1784.N.20220107.2020.006.html.

       作者簡(jiǎn)介：小泥沙，食品科技工作者，畢業(yè)于華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，食品科學(xué)碩士，現(xiàn)就職于國(guó)內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事?tīng)I(yíng)養(yǎng)食品的開(kāi)發(fā)與研究。