銀杏葉提取物的制備及質(zhì)量控制研究現(xiàn)狀

       銀杏葉提取物（GBE）是銀杏科植物銀杏的干燥葉經(jīng)加工制成的提取物，化學(xué)成分復(fù)雜。目前已從中分離到黃酮類化合物、萜類內(nèi)酯、、聚戊烯醇類、有機(jī)酸類等共計(jì)160余種化合物。其中黃酮類化合物和萜類內(nèi)酯是GBE及其制劑質(zhì)量控制的常規(guī)指標(biāo)，也是GBE的主要活性成分，其能改善心腦血管微循環(huán)、清除氧自由基，在高血壓、動(dòng)脈硬化、急性腦梗死等心腦血管疾病治療方面療效較好。以GBE為原料加工制成的銀杏葉片、膠囊和滴丸等制劑是目前在歐美非常受歡迎的食用增補(bǔ)劑和藥品。

       GBE的化學(xué)成分

       黃酮類化合物：主要包括黃酮及其苷、雙黃酮、黃酮醇及其苷、花色素等，其含量為2.5%~5.91%。黃酮類化合物有很強(qiáng)的抗氧活性，能清除氧自由基，防止脂質(zhì)過(guò)氧化，其中的槲皮素、山萘酚及異鼠李素還可升高血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，促進(jìn)NO的合成和釋放，從而舒張血管、改善心腦血管循環(huán)。

       萜類內(nèi)酯：共8個(gè)，根據(jù)結(jié)構(gòu)分為二萜類的銀杏內(nèi)酯和倍半萜類的白果內(nèi)酯。銀杏內(nèi)酯包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、J、K、L、M，具有抗血小板激活因子活性。萜類內(nèi)酯涉及超氧陰離子清除過(guò)程，能保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，可用于中風(fēng)、老年癡呆癥等疾病治療。銀杏萜類內(nèi)酯的分離與質(zhì)量控制已成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

       聚戊烯醇類：目前僅在銀杏葉中發(fā)現(xiàn)，是由10~20個(gè)異戊烯基單元線性連接和末端異戊烯醇結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)鏈化合物，包含順式和反式結(jié)構(gòu)，藥用開(kāi)發(fā)前景廣闊。

       其它有效成分：銀杏提取物中還含有多糖、酚類、有機(jī)酸類、氨基酸、微量元素等。

       GBE的制備方法

       有機(jī)溶劑提取法：該法在生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛，溶劑主要為乙醇-水溶液或丙酮-水溶液。通過(guò)將銀杏葉干燥粉碎、浸泡萃取、過(guò)濾蒸餾等，得到銀杏葉粗提物。在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)采用液-液萃取、沉淀、吸附洗脫等流程可得銀杏葉精提物，該法工藝復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)且產(chǎn)率低，產(chǎn)品中的殘留溶劑會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量。近年來(lái)樹(shù)脂吸附純化法越來(lái)越多的被應(yīng)用在銀杏葉提取工藝中，有研究發(fā)現(xiàn)所采用的吸附樹(shù)脂類型和工藝不同，黃酮醇苷和內(nèi)酯都有很好的收率，且各有特點(diǎn)。有研究以銀杏黃酮的吸附性能為指標(biāo)，篩選10種大孔樹(shù)脂發(fā)現(xiàn)，AB-8樹(shù)脂吸附性能優(yōu)良，吸附量為102.8mg/g，解析率為97.9%。樹(shù)脂吸附法生產(chǎn)工藝具有殘留有機(jī)溶劑少、成本低、回收率高的優(yōu)點(diǎn)，在GBE及制劑的制備和生產(chǎn)方面發(fā)展前景廣闊。

       超臨界流體提取法：相較于有機(jī)溶劑提取法，該法具有安全無(wú)毒、無(wú)溶劑殘留，活性成分及易揮發(fā)、熱敏性成分損失少、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)調(diào)控臨界溫度和壓力、改變改性劑的種類和用量，還可以選擇性的進(jìn)行目標(biāo)物萃取和分離純化。有研究建立了一套超臨界CO2萃取小試、中試裝置，并確定了最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行銀杏葉活性成分提取，得到的GBE中黃酮類和萜類內(nèi)酯的含量均高于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，分別為28%、7.2%。目前超臨界流體提取技術(shù)在中藥活性成分提取的應(yīng)用越來(lái)越廣泛 。

       高速逆流色譜技術(shù)提取法：是一種基于液-液分配原理、不需固定載體的新型色譜技術(shù)，其溶劑體系范圍廣、分離效率高、制備量大，非常適合中藥提取物的制備性分離。目前該技術(shù)已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于分離銀杏葉中黃酮類化合物、萜類內(nèi)酯及銀杏酸等，將成為制備銀杏黃酮類和萜類內(nèi)酯的較佳手段。

       GBE的質(zhì)量控制

       黃酮和萜類內(nèi)酯一直是銀杏葉及其制劑質(zhì)量控制的熱點(diǎn)。

       總黃酮醇苷：

       總黃酮醇苷是國(guó)際公認(rèn)的銀杏葉及其制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)。銀杏黃酮成分復(fù)雜，主要以黃酮苷的形式存在，難以對(duì)含量進(jìn)行直接測(cè)定。目前國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)中，通常先對(duì)樣品進(jìn)行酸解，然后采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定槲皮素、山 奈 素、異鼠李素的含量，再乘以校正系數(shù)來(lái)間接反映總黃酮醇苷含量，這種檢測(cè)方法不能全面準(zhǔn)確的反映產(chǎn)品的信息，在識(shí)假、辨假方面不足，有必要直接測(cè)定黃酮原形。有報(bào)道利用UPLC-MS/MS直接測(cè)定GBE中10個(gè)黃酮類成分原型，發(fā)現(xiàn)總黃酮含量在不同批次GBE中差異較大，為89.29mg/kg~114.18mg/kg，不同黃酮類成分在同一批次含量差異也較大，該方法可作為黃酮類成分質(zhì)量控制的一個(gè)補(bǔ)充。

       萜類內(nèi)酯：

       GBE的萜類內(nèi)酯化合物主要包括銀杏內(nèi)酯A（GA）、銀杏內(nèi)酯B（GB）、銀杏內(nèi)酯C（GC）和白果內(nèi)酯（BB）。萜類內(nèi)酯的紫外吸收較弱，國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)中通過(guò)反復(fù)萃取制備供試品溶液，采用HPLC-ELSD/RID法測(cè)定GA、GB、GC和BB含量?！吨袊?guó)藥典》2020年版（Chp2020）規(guī)定了四種成分的總含量限度，國(guó)外藥典GBE標(biāo)準(zhǔn)除規(guī)定總含量外，還對(duì)BB、GA+GB+GC含量范圍進(jìn)行限制。有報(bào)道用HPLC-ELSD法對(duì)6個(gè)不同廠家的GBE中萜類內(nèi)酯含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)廠家雖然四個(gè)成分的總含量（5.86%~8.41%）符合中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)，但是BB含量（1.78%~2.92%）、GA+GB+GC總含量（4.62%~6.39%）并未達(dá)到英美藥典要求。因此各GBE廠家有必要參考國(guó)外藥典，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行更嚴(yán)格的質(zhì)量控制，保證產(chǎn)品質(zhì)量。

       不可忽視的**物質(zhì)-銀杏酸

       銀杏酸主要為烷基酚酸類化合物，有致敏性、細(xì)胞**、胚胎**及神經(jīng)**等，是GBE及其制劑中的需嚴(yán)格控制的組分。國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)均采用HPLC法測(cè)定總銀杏酸的含量。目前Chp2020將銀杏酸限度標(biāo)準(zhǔn)由10mg/kg修訂為5mg/kg，與國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)一致。

       值得注意的是，Chp2020新增了指紋圖譜的檢測(cè)項(xiàng)，在乙腈-磷酸體系中以HPLC檢測(cè)GBE指紋圖譜，以蘆丁定位，與銀杏葉對(duì)照提取物指紋圖譜中的17個(gè)色譜峰比對(duì)，全峰匹配，按中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算，相似度應(yīng)≥0.90。此次修訂有利于提高國(guó)內(nèi)GBE的產(chǎn)品質(zhì)量。

       銀杏及其制劑在國(guó)際市場(chǎng)上非常熱銷，其質(zhì)量控制也越來(lái)越到重視。目前我國(guó)GBE生產(chǎn)廠家很多均遵循《中國(guó)藥典》要求進(jìn)行產(chǎn)品檢測(cè)，很少有廠家按照歐、美等國(guó)藥典限度要求進(jìn)行質(zhì)控。這樣導(dǎo)致我國(guó)雖然銀杏資源豐富，但產(chǎn)品質(zhì)量不能達(dá)到歐美等國(guó)家質(zhì)量要求而很少出口到這些國(guó)家，國(guó)產(chǎn)GBE大部分只能向低質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)國(guó)家出口，國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力弱。因此，在原料及工藝方面，國(guó)內(nèi)GBE廠家應(yīng)加強(qiáng)銀杏葉原料質(zhì)量控制，采用高效提取工藝進(jìn)行生產(chǎn)，并建立標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)流程。在質(zhì)量控制方面，目前，Chp2020僅規(guī)定了總黃酮醇苷和萜類內(nèi)酯的含量下限，建議國(guó)內(nèi)廠家應(yīng)參考國(guó)際藥典標(biāo)準(zhǔn)，制定合理的總黃酮醇苷和萜類內(nèi)酯含量范圍。此外，還應(yīng)考慮增加萜類內(nèi)酯中BB含量范圍和GA+GB+GC總含量范圍，制定出比中國(guó)藥典更嚴(yán)格的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，從整體上提升產(chǎn)品質(zhì)量，對(duì)于開(kāi)拓歐美GBE市場(chǎng)有重要意義。

       參考文獻(xiàn)：

       [1]李明飛,王成章. 銀杏葉提取物制備、檢測(cè)及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代化工,2020,40(01):29-32.

       [2]唐溱,姜典卓,趙曉霞,張永文. 銀杏葉提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比較及標(biāo)準(zhǔn)提高思路探討[J]. 中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn),2020,21(01):21-25.

       作者簡(jiǎn)介：沙羅，中藥研發(fā)工作者，中藥學(xué)碩士，現(xiàn)就職于國(guó)內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，致力于中藥新藥的研究開(kāi)發(fā)。