安全有效地將大分子遞送到體外培養(yǎng)或體內(nèi)的相關(guān)細(xì)胞中，是許多新興治療方式所必需的條件。例如，當(dāng)前的基因編輯技術(shù)往往受到遞送限制。
腺相關(guān)病毒（AAV）等病毒載體已被用于將基因編輯工具遞送至體內(nèi)多種組織，然而，AAV遞送受限于遞送貨物的尺寸限制，還可能存在整合風(fēng)險(xiǎn)。此外，AAV遞送的基因編輯工具會(huì)在細(xì)胞中長(zhǎng)期表達(dá)，這增加了脫靶編輯風(fēng)險(xiǎn)。
一些非病毒遞送載體，例如脂質(zhì)納米顆粒（LNP），通過(guò)瞬時(shí)遞送編碼基因編輯器的mRNA（而不是DNA），從而降低了脫靶編輯風(fēng)險(xiǎn)；然而，盡管最近取得了令人鼓舞的進(jìn)展，但利用LNP遞送技術(shù)在肝臟外組織實(shí)現(xiàn)治療性基因編輯仍然具有挑戰(zhàn)性。因此，需要開(kāi)發(fā)更多的遞送策略來(lái)克服現(xiàn)有方法的局限性。
2022年1月，劉如謙團(tuán)隊(duì)在 Cell 期刊發(fā)表論文【1】，開(kāi)發(fā)了一種不含DNA的工程化類(lèi)病毒顆粒（Engineered virus-like particles，eVLP），其結(jié)合了病毒載體和非病毒載體遞送的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)，能夠?qū)A基編輯器或Cas9核糖核蛋白遞送到多個(gè)器官，實(shí)現(xiàn)高效基因編輯，同時(shí)將脫靶效應(yīng)降至最低。
2024年11月13日，Broad研究所劉如謙團(tuán)隊(duì)在 Nature Biotechnology 期刊發(fā)表了題為：Directed evolution of engineered virus-like particles with improved production and transduction efficiencies 的研究論文【2】。
該研究利用定向進(jìn)化，開(kāi)發(fā)出來(lái)第五代工程化類(lèi)病毒顆粒（v5 eVLP），具有更高的生產(chǎn)效率和遞送效率。
近年來(lái)，研究人員探索了在體內(nèi)或體外使用類(lèi)病毒顆粒（VLP）作為向細(xì)胞內(nèi)遞送基因編輯工具的載體，VLP由病毒支架組成，用于包裝和遞送運(yùn)載蛋白、核糖核蛋白（RNP）或mRNA，因此，VLP遞送載體同時(shí)兼顧了病毒遞送方法的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)和組織趨向性，以及非病毒遞送方法的瞬時(shí)表達(dá)和減少脫靶編輯，這是基因編輯應(yīng)用的理想組合。
2022年1月，劉如謙團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了第四代（v4）工程化類(lèi)病毒顆粒（eVLP），與AAV遞送相比，該eVLP能夠?qū)崿F(xiàn)高效的體內(nèi)基因編輯和最小程度的脫靶編輯【1】。
2024年1月，劉如謙團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了用于遞送先導(dǎo)編輯器（PE）的工程化類(lèi)病毒顆粒系統(tǒng)——PE-eVLP，能夠向體內(nèi)遞送核糖核蛋白（RNP）形式的完整先導(dǎo)編輯系統(tǒng)，進(jìn)行瞬時(shí)先導(dǎo)編輯，在人類(lèi)細(xì)胞中進(jìn)行了高效先導(dǎo)編輯，在兩個(gè)遺傳性失明小鼠模型中實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)堿基編輯并恢復(fù)了部分視覺(jué)功能。PE-eVLP系統(tǒng)不僅支持體內(nèi)瞬時(shí)先導(dǎo)編輯，還能減少脫靶編輯、避免基因整合帶來(lái)的潛在致癌性，增強(qiáng)了先導(dǎo)編輯的安全性【3】。
eVLP
eVLP的這些良好特性表明，eVLP有望作為一種有效的體外和體內(nèi)遞送基因編輯RNP或其他治療性蛋白的新型遞送載體。
但我們還需要進(jìn)一步改進(jìn)eVLP的特性，以最大限度地發(fā)揮其研究和治療應(yīng)用的潛力。特別是提高eVLP包裝效率或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，從而使我們能夠以更低的eVLP劑量實(shí)現(xiàn)更高效的基因編輯。
實(shí)驗(yàn)室定向進(jìn)化是改進(jìn)遞送載體的一種有前景的方法，已被廣泛用于開(kāi)發(fā)病毒遞送載體?，F(xiàn)有的定向進(jìn)化方案要求每個(gè)病毒變體都包裝一個(gè)病毒基因組，該基因組編碼特定變體的特性，這允許對(duì)經(jīng)過(guò)選擇的病毒基因組進(jìn)行測(cè)序，以識(shí)別具有所需特性的變體。然而，由于eVLP不包裝任何病毒遺傳物質(zhì)，因此應(yīng)用定向進(jìn)化來(lái)改進(jìn)eVLP需要開(kāi)發(fā)另一種策略來(lái)編碼eVLP變體的身份。
為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種定向進(jìn)化系統(tǒng)，該系統(tǒng)中的每個(gè)eVLP變體包裝的RNP攜帶的guide RNA具有唯一標(biāo)識(shí)該特定eVLP變體的條形碼序列。在對(duì)特定性質(zhì)進(jìn)行選擇后，通過(guò)對(duì)幸存的帶有條形碼的guide RNA進(jìn)行測(cè)序，可以確定所需的eVLP變體。
利用該定向進(jìn)化系統(tǒng)，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一系列eVLP衣殼變體庫(kù)，并進(jìn)行了篩選，以鑒定出能夠提高生產(chǎn)細(xì)胞的eVLP產(chǎn)量或增強(qiáng)靶細(xì)胞eVLP轉(zhuǎn)導(dǎo)的衣殼變體。
通過(guò)結(jié)合有益的衣殼突變，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了第五代（v5）eVLP，其具有更高的RNP包裝能力、更好的遞送后釋放效果、獨(dú)特的衣殼結(jié)構(gòu)組成，以及比之前最 好的第四代（v4）eVLP高出2-4倍的向培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的遞送效率。對(duì)v5 eVLP的分析表明，這些衣殼突變優(yōu)化了對(duì)核糖核蛋白（RNP）貨物的包裝和遞送，并大大改變了eVLP衣殼結(jié)構(gòu)。
該研究描述的基于條形碼eVLP進(jìn)化方法，為開(kāi)發(fā)具有改進(jìn)性能的eVLP奠定了基礎(chǔ)，還可能廣泛應(yīng)用于開(kāi)發(fā)克服現(xiàn)有限制的新型遞送載體。
論文鏈接：
1. https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(21)01484-7
2. https://www.nature.com/articles/s41587-024-02467-x
3. https://www.nature.com/articles/s41587-023-02078-y
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