顛覆教科書！張鋒最新Science論文：發(fā)現(xiàn)“隱藏基因”，揭開(kāi)全新遺傳調(diào)控方式

       2024年8月28日，張鋒團(tuán)隊(duì)（徐沛雨和Makoto Saito為論文共同第一作者）在 Cell 期刊發(fā)表了題為：Structural Insights into the Diversity and DNA Cleavage Mechanism of Fanzor 的研究論文【1】。該研究展示了Fanzor蛋白在不同生物中所表現(xiàn)出的分子多樣性，并深入解析了其通過(guò)RNA引導(dǎo)的DNA切割機(jī)制，為進(jìn)一步的基因工程改造和開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

       僅僅一天后，張鋒團(tuán)隊(duì)在 Science 期刊發(fā)表重磅論文，該研究顛覆了教科書對(duì)遺傳信息線性傳遞方式的定義，也顛覆了染色體擁有細(xì)胞用來(lái)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的一整套完整遺傳指令的觀點(diǎn)，揭示了“隱藏基因”的存在，表明從非編碼RNA的基因合成是原核生物中的一種全新遺傳調(diào)控方式。

       1958年，DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)者之一——弗朗西斯·克里克（Francis Crick）提出了著名的“中心法則”，為遺傳信息的傳遞構(gòu)建一個(gè)大框架：DNA→RNA→蛋白質(zhì)。根據(jù)這一法則，DNA作為基因模板，轉(zhuǎn)錄生成RNA，RNA再翻譯為蛋白質(zhì)。

       1970年，科學(xué)家們?cè)谝恍┎《局邪l(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，這種酶可以將RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，這為中心法則做出了重要補(bǔ)充，揭示了遺傳信息并不只是單向流動(dòng)，也可以實(shí)現(xiàn)從RNA→DNA的逆向流動(dòng)。

       自遺傳密碼被破譯以來(lái)，我們打開(kāi)了生命的天書，通過(guò)閱讀和解碼我們的染色體，我們得以識(shí)別基因組中的基因，這種線性的生命法則被認(rèn)為支配著所有的生命形式——從細(xì)菌到人類。教科書上對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因的定義是它沿著DNA軸線性編碼，以便基因的起始端始終位于基因末端的上游。

       然而，張鋒團(tuán)隊(duì)的這篇 Science 論文，與哥倫比亞大學(xué) Samuel Sternberg 團(tuán)隊(duì)稍早些發(fā)表的 Science 論文一起，顛覆了教科書對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因的定義，揭示了細(xì)菌中特有的抗噬菌體蛋白，這些蛋白并非直接由細(xì)菌的DNA編碼，為了產(chǎn)生這些蛋白，DNA首先被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA（ncRNA），然后通過(guò)滾環(huán)逆轉(zhuǎn)錄（rolling circle reverse transcription）反應(yīng)將其轉(zhuǎn)換為DNA（即從頭產(chǎn)生新基因），由此產(chǎn)生的DNA隨后被轉(zhuǎn)錄為編碼抗噬菌體蛋白的mRNA，mRNA再編碼為抗噬菌體蛋白，幫助細(xì)菌克服病毒（噬菌體）的感染。 

       這兩項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了細(xì)菌逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板創(chuàng)造新基因的基因組編碼潛力，是對(duì)中心法則這一遺傳信息傳遞方式的挑戰(zhàn)，也將改變我們看待基因組DNA線性編碼遺傳信息的傳統(tǒng)范式。

       逆轉(zhuǎn)錄酶（Reverse transcriptase，RT）是一種利用RNA模板來(lái)合成DNA的酶，廣泛分布于生命的所有領(lǐng)域。這些酶在多個(gè)過(guò)程中發(fā)揮作用，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒和可移動(dòng)遺傳元件的生命周期以及端粒生物學(xué)。

       在細(xì)菌中，逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)于抗噬菌體防御尤為重要，并被多種遺傳系統(tǒng)所利用，這些遺傳系統(tǒng)的作用是保護(hù)細(xì)菌免受噬菌體感染。例如，一些CRISPR-Cas系統(tǒng)就是利用逆轉(zhuǎn)錄來(lái)獲取對(duì)抗RNA噬菌體的新的核酸免疫盒（spacers）。逆轉(zhuǎn)錄酶也用于被稱為反轉(zhuǎn)錄子（Retron）的抗噬菌體遺傳系統(tǒng)，該系統(tǒng)由三個(gè)基因組成，分別編碼一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶、一個(gè)非編碼RNA和一個(gè)“效應(yīng)”毒素。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，反轉(zhuǎn)錄子產(chǎn)生一條DNA和RNA共價(jià)連接的嵌合核酸鏈。這種嵌合的DNA-RNA分子的作用尚不清楚，但已知它通過(guò)控制效應(yīng)蛋白的毒性發(fā)揮抗噬菌體活性。此外，還有十多個(gè)其他細(xì)菌防御系統(tǒng)編碼逆轉(zhuǎn)錄酶，但在大多數(shù)這些系統(tǒng)中逆轉(zhuǎn)錄的作用尚不清楚。 

       張鋒團(tuán)隊(duì)和 Samuel Sternberg 團(tuán)隊(duì)各自獨(dú)立研究了肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）中的一種包含逆轉(zhuǎn)錄酶的防御系統(tǒng)——防御相關(guān)逆轉(zhuǎn)錄酶2（DRT2）。

       這兩項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn)，DRT2系統(tǒng)為細(xì)菌提供了強(qiáng)大的抗噬菌體防御能力，并且在感染期間，編碼DRT2的細(xì)菌停止生長(zhǎng)和分裂，不允許噬菌體復(fù)制。而DRT2系統(tǒng)僅編碼一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶和一個(gè)非編碼RNA（ncRNA），似乎沒(méi)有涉及任何其他蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或因子。

       因此，這兩項(xiàng)研究都進(jìn)一步探索了這種極簡(jiǎn)系統(tǒng)究竟是如何既能識(shí)別病毒（噬菌體）感染又能導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯的。他們發(fā)現(xiàn)，DRT2系統(tǒng)實(shí)際上編碼了另一種蛋白質(zhì)，但該蛋白質(zhì)的產(chǎn)生需要一系列復(fù)雜且意料之外的分子事件。 

       這兩項(xiàng)研究觀察到，逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）使用相關(guān)非編碼RNA（ncRNA）中一段特定的120個(gè)堿基作為模板來(lái)生成互補(bǔ)DNA（cDNA）。逆轉(zhuǎn)錄酶在一次逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中不會(huì)停止，而是跳回到120個(gè)堿基序列的起始點(diǎn)，并以所謂的“滾環(huán)”（rolling circle）反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，從而生成一個(gè)包含多個(gè)逆轉(zhuǎn)錄模板重復(fù)序列的長(zhǎng)cDNA。最常見(jiàn)的生成的cDNA包含模板的五個(gè)串聯(lián)重復(fù)，有些cDNA甚至包含一百多個(gè)這樣的重復(fù)。 

       那么，這些cDNA可能起到什么作用呢？

       這兩項(xiàng)研究都指出，cDNA包含的序列基序幾乎與細(xì)菌σ70啟動(dòng)子的共有序列相同。這些啟動(dòng)子由兩個(gè)序列基序組成，即-35和-10基序（之所以這樣稱呼，是因?yàn)樗鼈兎謩e位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游35個(gè)和約10個(gè)堿基處）。DRT2系統(tǒng)ncRNA序列中的模板重復(fù)包含這兩個(gè)基序，但排列方式不同，因此單個(gè)重復(fù)無(wú)法形成有效的啟動(dòng)子；但當(dāng)連接到cDNA上時(shí)，一個(gè)重復(fù)末端的-35基序與下一個(gè)重復(fù)開(kāi)頭的-10基序處于正確的方向和距離，形成一個(gè)強(qiáng)大的啟動(dòng)子，激活了高轉(zhuǎn)錄率。 

       這兩項(xiàng)研究進(jìn)一步確定，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)了mRNA轉(zhuǎn)錄，而這個(gè)mRNA反過(guò)來(lái)編碼了一種蛋白質(zhì)，從串聯(lián)的cDNA轉(zhuǎn)錄的mRNA不包含任何終止密碼子，由于該蛋白質(zhì)可能會(huì)非常長(zhǎng)（取決于cDNA中的重復(fù)次數(shù)），張鋒團(tuán)隊(duì)和 Samuel Sternberg 團(tuán)隊(duì)都將其命名為Neo，意為“永無(wú)止境的開(kāi)放閱讀框”（Never-Ending Open reading frame），這一命名也致敬了電影《黑客帝國(guó)》中的男主角救世主尼奧（Neo）。

       那么，DRT2系統(tǒng)是如何幫助細(xì)菌對(duì)抗噬菌體感染的呢？

       研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，DRT2產(chǎn)生單鏈串聯(lián)的cDNA，但只有當(dāng)細(xì)菌被噬菌體感染時(shí)，第二條鏈的合成才會(huì)啟動(dòng)。一旦形成雙鏈cDNA，啟動(dòng)子就會(huì)其驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄為mRNA，隨后mRN被翻譯成Neo蛋白，這種毒蛋白能夠迅速抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，從而阻止噬菌體復(fù)制和利用細(xì)胞資源。

       編碼Neo蛋白所必需的遺傳信息流非常不尋常。這種不常規(guī)的蛋白質(zhì)編碼機(jī)制有什么好處呢？

       研究團(tuán)隊(duì)提供了兩種可能的解釋。一種解釋是，有毒基因的表達(dá)難以控制，其轉(zhuǎn)錄泄漏會(huì)導(dǎo)致不良后果，這被認(rèn)為是編碼毒素的防御系統(tǒng)在短的進(jìn)化時(shí)間尺度內(nèi)往往經(jīng)常丟失的原因。在DRT2系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄泄漏引起的自身免疫問(wèn)題得到了解決，因?yàn)閱蝹€(gè)重復(fù)序列不包含啟動(dòng)子并且本身無(wú)毒。另一種解釋是，裂解性噬菌體在感染早期往往會(huì)降解宿主的基因組，部分原因是為了關(guān)閉細(xì)胞通過(guò)免疫蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯來(lái)應(yīng)對(duì)感染的能力。而DRT2系統(tǒng)巧妙地克服了這一挑戰(zhàn)，它依賴于一種在感染前已被轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA（ncRNA），一旦噬菌體的DNA降解活性停止，就可以將這種ncRNA轉(zhuǎn)換回DNA。

       目前尚不清楚DRT2系統(tǒng)如何感知噬菌體的存在，以及是什么分子機(jī)制激活了第二條cDNA鏈的合成。盡管 Samuel Sternberg 團(tuán)隊(duì)的研究表明第二條鏈的合成是從與ncRNA末端共價(jià)連接的短DNA引物開(kāi)始的，但這種引物是如何產(chǎn)生的還不清楚。

       此外，還有一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題——Neo蛋白是如何抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的，Neo與任何已知的蛋白質(zhì)都不相似，它抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的機(jī)制仍然是個(gè)謎。 

       來(lái)自細(xì)菌防御系統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄酶，特別是來(lái)自反轉(zhuǎn)錄子（Retron）的逆轉(zhuǎn)錄酶，因其能夠生成所選擇的cDNA而被用于基因組編輯。DRT2系統(tǒng)通過(guò)滾環(huán)逆轉(zhuǎn)錄生成雙鏈DNA的能力可能有助于生物技術(shù)應(yīng)用，利用其擴(kuò)增和連接模板序列的能力。此外，細(xì)菌防御系統(tǒng)還編碼了數(shù)十種逆轉(zhuǎn)錄酶，而它們的機(jī)制尚有待探索。 

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