DMSO快速增強HEK-293細胞蛋白表達技術

       二甲基亞砜（DMSO）作為一種關鍵的極性非質子溶劑，在室溫條件下呈透明無色液態(tài)。它不僅在化學反應中扮演重要角色，也常作為溶劑使用。DMSO的兩親性質使其能有效溶解多種小分子疏水性藥物。此外，DMSO還因其卓越的膜滲透性而廣泛應用于細胞和組織的冷凍保護。DMSO能夠改變細胞膜的通透性，促進DNA質粒的細胞內攝取，從而可能提升蛋白表達水平。

       本研究旨在探索DMSO對HEK-293細胞轉染效率的潛在提升作用。研究將確定DMSO的最佳作用濃度和時間，以期在不引起細胞毒性的前提下最大化轉染效率。需要注意的是，DMSO在活細胞中的濃度越高或作用時間越長，其細胞毒性可能越大，因為DMSO可能降低細胞膜的剛性，高濃度下甚至可能誘導膜孔的形成。HEK-293細胞系是一種廣泛應用于重組蛋白表達的細胞系，其轉染效率高，翻譯后修飾正確，且蛋白表達速度快，通常在48小時內達到高峰。對于需要在單細胞水平研究膜蛋白的科研人員來說，提高HEK-293細胞中重組蛋白的表達效率尤為關鍵。

       本實驗進一步研究了DMSO處理對HEK-293細胞轉染效率和表達量的影響。研究團隊采用GFP作為報告蛋白，通過測定表達GFP的細胞百分比來評估轉染效率，并監(jiān)測DMSO對細胞可能造成的潛在損害。最終，研究選用了磷酸鈣法進行HEK-293細胞的瞬時轉染。盡管市場上有許多基于脂質體的轉染試劑，磷酸鈣法依然是一種簡便、高效且成本低廉的轉染手段，適用于多種貼壁和懸浮細胞的轉染工作。

       結果

       DMSO的作用

       為了探究DMSO對HEK-293細胞中重組蛋白短暫表達的影響，研究團隊首先進行了GFP的轉染實驗。與未處理的對照組相比（見圖1A右側），在細胞轉染后4小時加入DMSO至培養(yǎng)基中，似乎能夠提升GFP陽性細胞的數(shù)量（見圖1B右側）。實驗圖像顯示，與未經DMSO處理的培養(yǎng)皿相比，經過DMSO處理的培養(yǎng)皿中觀察到更多或更亮的GFP陽性細胞（見圖1C及其說明）。

       在轉染GFP質粒后的4小時內，研究者將DMSO加入到細胞培養(yǎng)中。常規(guī)操作中，轉染液被添加到細胞上，隨后培養(yǎng)皿被放回37℃的培養(yǎng)箱中。4小時后，轉染液被常規(guī)生長培養(yǎng)基替換。研究者嘗試將DMSO與轉染液預先混合后加入細胞，但發(fā)現(xiàn)這樣做會導致活細胞數(shù)量顯著減少，這可能是由于DMSO與細胞共孵育4小時對細胞產生了毒性。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)，將DMSO與轉染液混合會在混合物中形成沉淀。

       因此，研究者決定在細胞轉染后等待4小時再進行DMSO處理。也就是說，在轉染4小時后，研究者取出轉染的培養(yǎng)皿，首先用PBS進行洗滌，然后進行DMSO處理。DMSO處理結束后，再次用PBS洗滌培養(yǎng)皿，并在放回培養(yǎng)箱前補充完全生長培養(yǎng)基。這一調整后的步驟有助于避免DMSO可能引起的細胞毒性，同時保持了轉染效率。

圖1:DMSO對HEK-293T細胞中GFP瞬轉表達的影響

       最佳DMSO濃度和賦予時間的研究

       隨后，研究者著手探究用于轉染HEK-293細胞的DMSO處理的最佳濃度和時間。這一點至關重要，因為DMSO在較高濃度或長時間作用下可能會對細胞造成傷害。眾所周知，DMSO即使在較低濃度下，長時間接觸也可能帶來細胞毒性。為了找到最合適的DMSO濃度，研究者在PBS中對4種不同濃度的DMSO進行了測試，這些濃度分別是5%、10%、15%和20%（體積比%；見圖2），處理時間為5分鐘，同時設有對照組，即未經DMSO處理，僅用PBS緩沖液處理的培養(yǎng)皿。根據(jù)圖2A的結果，10%的DMSO處理能夠帶來更高比例的GFP陽性細胞。與此相對，5% DMSO并未相較于對照組顯著增加GFP陽性細胞的數(shù)量。而更高濃度的DMSO處理則導致GFP陽性細胞數(shù)量顯著下降。在10% DMSO濃度下，研究者還觀察到亮度最高的GFP陽性細胞百分比最高。

       在確定了10%為最佳DMSO濃度后，研究者接著測試了不同的處理時間，從2分鐘到15分鐘不等，以10% DMSO溶液在室溫下孵育細胞。結果顯示，大約5分鐘的孵育時間最為理想（見圖2B）。與對照組相比，較短的孵育時間（如2分鐘）對GFP陽性細胞數(shù)量的影響不大。而當DMSO孵育時間超過5分鐘后，GFP陽性細胞數(shù)量有所下降。綜合圖1和圖2的實驗結果，研究者得出結論，10% DMSO溶液對轉染細胞進行5分鐘的孵育是最佳方案。

圖2：確定DMSO的最佳濃度和孵育時間

       DMSO孵育后GFP表達隨時間的變化

       接著，研究者對經DMSO處理的培養(yǎng)皿中GFP表達水平隨時間的變化進行了追蹤觀察。具體而言，他們對DMSO處理組和對照組（未處理）培養(yǎng)皿中6天內表達GFP的細胞百分比進行了測定。研究結果顯示，在觀察期間，DMSO處理組的GFP表達始終高于未處理組（對照組見圖3B，處理組見圖3A）。此外，兩組細胞在培養(yǎng)第2天均達到GFP表達的峰值（見圖3C）。通過分析第2天的數(shù)據(jù)，研究者發(fā)現(xiàn)，在轉染后4小時采用5% DMSO進行5分鐘處理的培養(yǎng)皿中，表達GFP的細胞平均增加了約1.6倍。

       從第3天起，兩組細胞培養(yǎng)液的總體熒光強度開始逐步下降（見圖3C）。研究者還發(fā)現(xiàn)，在33℃的較低溫度下培養(yǎng)細胞，與37℃標準培養(yǎng)溫度相比，低溫環(huán)境有助于保持更多的細胞存活。實際上，未處理的細胞在第2天后也表現(xiàn)出類似的下降趨勢（見圖3C），這與研究者之前對常規(guī)HEK-293細胞培養(yǎng)條件（無DMSO處理）的觀察相符，進一步證實了短時間DMSO孵育（5分鐘）對轉染后的HEK-293細胞狀態(tài)的影響微乎其微。

       綜合分析，從第2天起綠色細胞百分比的下降可能主要是由于蛋白質的內在降解和/或細胞的裂解。有研究指出，GFP在哺乳動物細胞中的半衰期大約為26小時。在哺乳動物細胞（如HEK-293細胞）中進行重組蛋白的瞬時轉染時，通常選擇在轉染后24至72小時內收集細胞，因為這個時間段內蛋白質的表達量最高。研究者所觀察到的現(xiàn)象（見圖3）正符合這一時間窗口。

圖3：DMSO孵育后GFP表達的時間過程

       結論

       短暫轉染的哺乳動物細胞培養(yǎng)物表達重組蛋白的生產力取決于多種因素。這些因素包括宿主細胞類型、基因轉錄和翻譯速率、基因表達的穩(wěn)定性、細胞中的翻譯后修飾以及轉染效率。一旦選擇了細胞來源或細胞系，操縱轉染效率可能是提高基因產物產量最有效的方法之一。使HEK-293細胞成為短暫基因表達系統(tǒng)的一個吸引人的選擇的各種屬性之一是這些細胞可以很容易地被操縱?；谶@一理念，我們研究了，并在這里報告，短暫暴露DMSO對轉染細胞的生產力對短暫表達產量的影響。正如我們在這項研究中所展示的，將10% DMSO暴露于4小時后轉染感興趣重組蛋白的HEK-293細胞，可以提高表達產量約1.6倍，而對細胞的活性或生長沒有任何負面影響。

       我們研究中的一個重要發(fā)現(xiàn)是，DMSO對細胞的暴露應該在細胞已經暴露于轉染試劑后4小時發(fā)生；在我們的例子中，我們使用了鈣磷酸鹽DNA共沉淀。在這種情況下，認為與細胞的轉染混合物4小時孵化足以允許吸收細胞表面的外來DNA。這是我們通常會用完整培養(yǎng)基替換轉染溶液，然后將轉染培養(yǎng)物放回孵化器的時間。因此，用DMSO處理培養(yǎng)物5分鐘只是完整培養(yǎng)基交換之前的一個額外步驟。然而，應注意，在DMSO處理后進行培養(yǎng)基替換期間，因為經過DMSO處理的細胞容易在培養(yǎng)基交換時被沖走。如果一個人希望收獲整個培養(yǎng)物而不僅僅是使用一小部分細胞進行電生理學研究，這一點將特別重要。關于這一點，我們還最初嘗試使用相同的協(xié)議，即5分鐘10% DMSO處理，使用懸浮適應的HEK-293S細胞。我們發(fā)現(xiàn)在HEK-293S細胞中也有類似的增強，但是培養(yǎng)皿必須首先涂覆膠原蛋白；否則在去除DMSO溶液并清洗培養(yǎng)皿之前，會有大量的細胞丟失。顯然，通過移液管將DMSO溶液從培養(yǎng)皿中分離出來是適合靜態(tài)培養(yǎng)的?？偟膩碚f，我們描述的方法很容易實施，考慮到鈣磷酸鹽DNA共沉淀協(xié)議是將外來基因引入哺乳動物細胞的一種簡單、經濟的方式。實際上，自從Graham和Van der Eb在1973年報道這種方法用于轉染腺病毒DNA和猴病毒40進入哺乳動物細胞以來，鈣磷酸鹽轉染一直是引入基因的流行的方法之一。

       對轉染的HEK-293細胞使用10% DMSO進行5分鐘處理，由此增加了約1.6倍的轉染效率，這一效果很可能歸因于DMSO分子提高膜滲透性的能力，通過滲透作用以及DMSO誘導的膜上磷脂頭基的脫水作用。因此，更多的cDNA質粒能夠進入細胞，或者通過內吞作用準確地被細胞攝取，并最終進入細胞核。然而，更高濃度的DMSO或更長時間的DMSO暴露具有細胞毒性。即使是較低濃度的DMSO，但長時間暴露或極端情況下，長期將DMSO培養(yǎng)在培養(yǎng)基中，也可能對細胞造成傷害。在這項研究中，我們展示了盡管將同一DMSO濃度（即10%）的暴露時間從5分鐘延長到10分鐘，并不會導致細胞計數(shù)降低，至少不會顯著降低，但它確實導致了蛋白表達百分比的降低，正如GFP實驗中所見。在這種情況下，蛋白質產量的減少，而不是細胞數(shù)量，可能歸因于DMSO處理對轉錄的負面影響。DMSO的過度暴露可能會抑制細胞核糖體的功能。只要將暴露時間保持簡短或精確地5分鐘，這樣的程序就可以在不損害細胞活性、細胞生長或在HEK-293細胞中表達的蛋白質的功能屬性的情況下，產生更高的短暫轉染產量。