Cell：周琪/李偉團(tuán)隊(duì)改造R2逆轉(zhuǎn)座子，實(shí)現(xiàn)全RNA介導(dǎo)的精準(zhǔn)大片段基因?qū)懭?/h1>

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來(lái)源：生物世界

  2024-07-09

研究結(jié)合基因組數(shù)據(jù)挖掘和大分子工程改造等手段，開(kāi)發(fā)了使用RNA供體進(jìn)行大片段基因精準(zhǔn)寫(xiě)入的R2逆轉(zhuǎn)座子工具，能夠在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、原代細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)大片段基因（>1.5 kb）高效精準(zhǔn)的整合，最高效率超過(guò)60%，成功實(shí)現(xiàn)了全RNA介導(dǎo)的功能基因（DNA）在多種哺乳動(dòng)物基因組的精準(zhǔn)寫(xiě)入，為新一代創(chuàng)新基因療法的發(fā)展提供了基礎(chǔ)。

       基因組DNA是生命的藍(lán)圖，對(duì)基因組DNA實(shí)現(xiàn)任意尺度的精準(zhǔn)操作代表對(duì)生命藍(lán)圖進(jìn)行修改繪制的底層能力，是基因工程技術(shù)發(fā)展的核心。以CRISPR基因編輯技術(shù)為代表的技術(shù)進(jìn)步已經(jīng)基本實(shí)現(xiàn)了單堿基和短序列尺度的精準(zhǔn)編輯。然而，如何針對(duì)應(yīng)用場(chǎng)景的需求，實(shí)現(xiàn)大片段基因尺度的DNA在基因組的高效精準(zhǔn)整合，仍然是整個(gè)基因工程領(lǐng)域亟需突破的難題。如果該技術(shù)得到突破，意味著可以通過(guò)外源功能基因的精準(zhǔn)寫(xiě)入來(lái)干預(yù)涵蓋不同位點(diǎn)多種突變譜的基因所導(dǎo)致的遺傳缺陷等疾病，從而開(kāi)發(fā)更為通用的基因與細(xì)胞療法，具有廣泛的應(yīng)用前景。

       針對(duì)這一重大技術(shù)挑戰(zhàn)，多種基因?qū)懭?/strong>（gene writing）技術(shù)已被開(kāi)發(fā)，但是這些技術(shù)大多依賴于DNA模板作為基因?qū)懭氲墓w（donor）。在實(shí)際醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，DNA供體面臨免疫原性高、在體遞送困難、在基因組中具有隨機(jī)整合風(fēng)險(xiǎn)等諸多挑戰(zhàn)。相比之下，RNA供體具有更低的免疫原性、可被非病毒載體有效遞送、在細(xì)胞內(nèi)迅速降解，無(wú)隨機(jī)整合風(fēng)險(xiǎn)等特點(diǎn)，能有效應(yīng)對(duì)DNA供體所面臨的挑戰(zhàn)。因此，以RNA為供體的大片段精準(zhǔn)寫(xiě)入技術(shù)，在安全性、可遞送性方面都具有顯著優(yōu)勢(shì)。然而，現(xiàn)有以RNA為供體的技術(shù)，要么無(wú)法實(shí)現(xiàn)>200 bp的DNA片段高效整合（例如先導(dǎo)編輯等），要么依靠基因組隨機(jī)整合從而帶來(lái)基因組隨機(jī)突變風(fēng)險(xiǎn)（例如逆轉(zhuǎn)錄病毒等）。

是否能夠以RNA作為供體，實(shí)現(xiàn)功能基因尺度的大片段 DNA 基因組精準(zhǔn)定點(diǎn)整合？仍然是基因工程領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)。

       R2逆轉(zhuǎn)座子是真核生物中廣泛存在的一種以RNA作為媒介的逆轉(zhuǎn)座子，它專一性地“定居”在宿主28S rDNA基因組位點(diǎn)上，借助宿主基因的啟動(dòng)子，合成自身的RNA和蛋白質(zhì)并組裝形成R2復(fù)合物。R2復(fù)合物可再次識(shí)別宿主28S rDNA上的專一性位點(diǎn),通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將R2基因序列重新整合到宿主基因組上，完成“增殖”。這一機(jī)制與以RNA作為供體的基因?qū)懭牍ぞ叩拈_(kāi)發(fā)思路不謀而合，同時(shí)，28S rDNA位點(diǎn)在人基因組中拷貝數(shù)目多（約219個(gè)），且遠(yuǎn)離蛋白編碼基因，是適合于外源基因整合的安全港位點(diǎn)。

       因此，R2逆轉(zhuǎn)座子是以RNA為供體的大片段基因精準(zhǔn)寫(xiě)入工具開(kāi)發(fā)的有力的候選者。然而，盡管R2逆轉(zhuǎn)座子早在上世紀(jì)80年代就被發(fā)現(xiàn)，其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的功能性質(zhì)尚未被系統(tǒng)性地探索，迄今為止，未能被利用來(lái)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)大片段功能基因的有效整合。

       2024年7月8日，北京干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究院/中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所李偉研究員與周琪院士團(tuán)隊(duì)合作，在國(guó)際頂尖學(xué)術(shù)期刊 Cell 上發(fā)表了題為：All-RNA-mediated Targeted Gene Integration in Mammalian Cells with Rationally Engineered R2 Retrotransposons 的研究論文。

       該研究結(jié)合基因組數(shù)據(jù)挖掘和大分子工程改造等手段，開(kāi)發(fā)了使用RNA供體進(jìn)行大片段基因精準(zhǔn)寫(xiě)入的R2逆轉(zhuǎn)座子工具，能夠在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、原代細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)大片段基因（>1.5 kb）高效精準(zhǔn)的整合，最高效率超過(guò)60%，成功實(shí)現(xiàn)了全RNA介導(dǎo)的功能基因（DNA）在多種哺乳動(dòng)物基因組的精準(zhǔn)寫(xiě)入，為新一代創(chuàng)新基因療法的發(fā)展提供了基礎(chǔ)。

       在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)首先通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘，全面系統(tǒng)地分析了自然界中R2逆轉(zhuǎn)座子元件的生物多樣性；通過(guò)構(gòu)建基于RNA供體的基因?qū)懭氲膱?bào)告體系，成功篩選出在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有完整GFP基因整合活性的R2Tg系統(tǒng)（來(lái)源于一種鳥(niǎo)Taeniopygia guttat的基因組）。

       為了探究影響R2整合活性的因素，研究團(tuán)隊(duì)從R2Tg系統(tǒng)的供體RNA與R2Tg蛋白兩方面做了系統(tǒng)性探究與工程化改造。對(duì)于R2Tg供體RNA中的UTR元件，研究團(tuán)隊(duì)首先通過(guò)SHAPE-MaP實(shí)驗(yàn)以及多序列比對(duì)，繪制了UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)合序列刪減或位點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)5'UT中含有HDV樣核酶，并且在R2的整合過(guò)程發(fā)揮重要的功能。同時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)刪除3'UTR中的一段莖環(huán)結(jié)構(gòu)可以顯著提升R2在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的逆轉(zhuǎn)座效率。對(duì)于R2Tg蛋白，研究團(tuán)隊(duì)使用AlphaFold2預(yù)測(cè)了R2T蛋白的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)合R2蛋白質(zhì)進(jìn)化信息，在R2蛋白中引入氨基酸點(diǎn)突變，或者偶聯(lián)與核酸結(jié)合或加工相關(guān)的小蛋白結(jié)構(gòu)域，均成功提高了R2系統(tǒng)的活性。結(jié)合上述工程化的供體RNA與蛋白進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，研究團(tuán)隊(duì)最終獲得了在人細(xì)胞系中超過(guò)20%基因整合效率的en-R2Tg工具。

       

系統(tǒng)的工程化改造獲得en-R2Tg工具

       由于R2蛋白質(zhì)可以通過(guò)mRNA表達(dá)，且供體RNA本身也是RNA，那么，en-R2Tg工具能否以全RNA形式介導(dǎo)的基因的高效精準(zhǔn)寫(xiě)入？

       為了探究這一點(diǎn)，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)體外合成獲得了編碼R2蛋白質(zhì)mRNA以及供體RNA，并使用脂質(zhì)體遞送的方式將兩條mRNA導(dǎo)入人的細(xì)胞中。結(jié)果顯示，en-R2Tg工具能夠高效整合多個(gè)與疾病治療相關(guān)基因，且這些基因能夠有效表達(dá)功能蛋白。能夠以全RNA的形式發(fā)揮功能，意味著en-R2Tg工具可以使用安全性已經(jīng)在臨床上得到證明的紙質(zhì)納米顆粒（LNP）進(jìn)行遞送，這將有可能解決長(zhǎng)久以來(lái)基因?qū)懭牍ぞ咭蕾嚥《据d體進(jìn)行高效遞送的難題。

       研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，使用LNP遞送en-R2Tg工具在人的肝臟細(xì)胞系中能夠?qū)崿F(xiàn)25%的基因整合效率。此外，研究團(tuán)隊(duì)還證明R2工具在人類原代細(xì)胞中同樣具有活性；同時(shí)，通過(guò)顯微注射將en-R2Tg工具導(dǎo)入小鼠胚胎，成功實(shí)現(xiàn)了超過(guò)60%的GFP基因定點(diǎn)整合效率。

       該研究的另一關(guān)鍵點(diǎn)在于，工程化改造的en-R2Tg工具是否還保留有天然R2逆轉(zhuǎn)座子的28S rDNA位點(diǎn)特異性整合這一性質(zhì)？

       為了回答這一問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合無(wú)偏好的基因整合富集高通量測(cè)序以及全基因組三代測(cè)序方法，發(fā)現(xiàn)en-R2Tg工具在全基因組范圍內(nèi)展現(xiàn)了極高的基因整合特異性，大于99%的外源基因都精準(zhǔn)整合到28S rDNA安全港位點(diǎn)。同時(shí)，結(jié)合qRT-PCR以及RNA-Seq實(shí)驗(yàn)，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)en-R2Tg工具對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)幾乎沒(méi)有影響。這說(shuō)明en-R2Tg介導(dǎo)的基因?qū)懭胧俏稽c(diǎn)精準(zhǔn)特異的，可以有效避免逆轉(zhuǎn)錄病毒等技術(shù)所產(chǎn)生的基因隨機(jī)整合導(dǎo)致的基因突變風(fēng)險(xiǎn)。

       

       全RNA介導(dǎo)的、高效精準(zhǔn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞大片段功能基因?qū)懭牍ぞ?/p>

       綜上，該研究基于自然界存在的R2逆轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，結(jié)合數(shù)據(jù)分析和工程化改造方法，成功開(kāi)發(fā)了全RNA介導(dǎo)的、高效精準(zhǔn)的基因?qū)懭爰夹g(shù)，首次在多種人和小鼠細(xì)胞系及原代細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了功能基因的定點(diǎn)整合。R2基因精準(zhǔn)寫(xiě)入工具在遞送和安全性方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，未來(lái)有望基于此工具開(kāi)發(fā)在體功能基因回補(bǔ)寫(xiě)入以及在體生成CAR-T細(xì)胞等全新的疾病治療方法。值得注意的是，R2基因?qū)懭爰夹g(shù)目前無(wú)法實(shí)現(xiàn)在不同基因組位點(diǎn)的可編程寫(xiě)入，且在人原代細(xì)胞中的基因?qū)懭胄瘦^低，因此未來(lái)需要進(jìn)一步發(fā)展和優(yōu)化。

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