Nature子刊：清華大學(xué)藍(lán)勛/李寅青/朱明團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)通用型基因編輯脫靶檢測(cè)技術(shù)

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來(lái)源：生物世界

2024-07-03

近年來(lái)，隨著諸如胞嘧啶堿基編輯器（CBE）、腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和先導(dǎo)編輯器?（prime editor, PE）等新型基因編輯工具不斷被開(kāi)發(fā)，CRISPR-Cas系統(tǒng)引領(lǐng)的基因編輯技術(shù)在眾多領(lǐng)域展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力。然而，脫靶效應(yīng)——即在預(yù)期目標(biāo)之外產(chǎn)生的編輯——不僅影響了生物學(xué)研究的準(zhǔn)確性，也給基因治療的臨床應(yīng)用帶來(lái)了潛在的安全隱患。2023年美國(guó)FDA在審查首個(gè)CRISPR基因編輯療法的上市申請(qǐng)時(shí)，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，尤其是脫靶效應(yīng)是其關(guān)注焦點(diǎn)。高效且精準(zhǔn)地檢測(cè)脫靶效應(yīng)成為了基因編輯技術(shù)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一。

近年來(lái)，隨著諸如胞嘧啶堿基編輯器（CBE）、腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和先導(dǎo)編輯器（prime editor, PE）等新型基因編輯工具不斷被開(kāi)發(fā)，CRISPR-Cas系統(tǒng)引領(lǐng)的基因編輯技術(shù)在眾多領(lǐng)域展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力。然而，脫靶效應(yīng)——即在預(yù)期目標(biāo)之外產(chǎn)生的編輯——不僅影響了生物學(xué)研究的準(zhǔn)確性，也給基因治療的臨床應(yīng)用帶來(lái)了潛在的安全隱患。2023年美國(guó)FDA在審查首個(gè)CRISPR基因編輯療法的上市申請(qǐng)時(shí)，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，尤其是脫靶效應(yīng)是其關(guān)注焦點(diǎn)。高效且精準(zhǔn)地檢測(cè)脫靶效應(yīng)成為了基因編輯技術(shù)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一。

為應(yīng)對(duì)脫靶挑戰(zhàn)，科學(xué)界提出了多種檢測(cè)方法，包括基于生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)、生物化學(xué)檢測(cè)和細(xì)胞水平檢測(cè)方法。然而現(xiàn)存方法普適性較低，或僅針對(duì)有限的編輯系統(tǒng)或細(xì)胞類型設(shè)計(jì)，并且大多數(shù)方法無(wú)法應(yīng)用于離體及體內(nèi)編輯時(shí)的脫靶檢測(cè)。

2024年7月2日17時(shí)，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院藍(lán)勛團(tuán)隊(duì)與藥學(xué)院李寅青團(tuán)隊(duì)合作，在 Nature Biotechnology 期刊上發(fā)表了題為：Tracking-seq reveals the heterogeneity of off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome editing 的研究論文。

該研究報(bào)道了一項(xiàng)名為Tracking-seq的新型脫靶效應(yīng)檢測(cè)技術(shù)，并借助該技術(shù)揭示了不同細(xì)胞類型、不同編輯工具間存在的脫靶效應(yīng)異質(zhì)性。該研究將為基因編輯在基因治療等領(lǐng)域的安全應(yīng)用提供重要理論參考及技術(shù)支持。

Tracking-seq reveals the heterogeneity of off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome editing 研究論文

目前的主流基因編輯器均依賴于DNA損傷后的修復(fù)過(guò)程實(shí)現(xiàn)基因編輯，復(fù)制蛋白A（replication protein A，RPA）廣泛存在于基因組雙鏈及單鏈損傷修復(fù)過(guò)程，Tracking-seq通過(guò)CUT&RUN技術(shù)特異性地識(shí)別并捕獲與RPA結(jié)合的單鏈DNA（Single-stranded DNA，ssDNA），隨后利用鏈特異性核酸酶消化雙鏈DNA以提高信噪比，構(gòu)建鏈特異性ssDNA文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，并通過(guò)新開(kāi)發(fā)的算法精確計(jì)算RPA信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)多種編輯工具的脫靶檢測(cè)。

圖1. Tracking-seq示意圖

相較于現(xiàn)有的GUIDE-seq和DISCOVER-seq等脫靶檢測(cè)技術(shù)，Tracking-seq不僅展現(xiàn)了高召回率，而且具備很高的檢測(cè)精確度。重要的是，其具有高度的泛用性，使其能夠適用于Cas9、CBE、ABE以及PE等各類主流基因編輯工具，并能適應(yīng)不同的細(xì)胞類型及不同的編輯環(huán)境（包括體外、離體及體內(nèi)編輯）。此外，Tracking-seq的高靈敏度使其能夠在僅有數(shù)千個(gè)細(xì)胞的樣品中，有效地進(jìn)行脫靶檢測(cè)，并保持優(yōu)異的結(jié)果。

圖2. Tracking-seq檢測(cè)不同編輯工具的鏈特異性信號(hào)

得益于Tracking-seq的高泛用性，該研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用相同的向?qū)NA時(shí)，Cas9、CBE、ABE和PE的脫靶效應(yīng)存在明顯差異，其中Cas9和CBE之間觀測(cè)到了許多近似于各自特異的脫靶位點(diǎn)。此外，不同類型的細(xì)胞中也觀察到了脫靶效應(yīng)的異質(zhì)性，脫靶事件似乎更容易在染色質(zhì)開(kāi)放和活躍的區(qū)域發(fā)生。這些脫靶效應(yīng)的異質(zhì)性提示，使用替代性編輯系統(tǒng)或在不同細(xì)胞類型中進(jìn)行的脫靶檢測(cè)，可能無(wú)法準(zhǔn)確反映目標(biāo)細(xì)胞中實(shí)際的脫靶情況。相比之下，Tracking-seq技術(shù)能夠直接對(duì)原始編輯系統(tǒng)進(jìn)行脫靶檢測(cè)，因此具有廣闊的應(yīng)用潛力和前景。

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