TPD技術(shù)最新發(fā)展：溶酶體或蛋白酶體直接參與的靶向蛋白質(zhì)降解

       靶向蛋白降解（Targeted protein degradation, TPD）已經(jīng)被確立為一種可行的替代方法，可以在生物學(xué)和臨床環(huán)境中減弱特定蛋白的功能。獨特的TPD作用模式使以前不可藥物的蛋白質(zhì)成為可行的靶標，擴大了可藥物特性和特權(quán)靶標蛋白質(zhì)的范圍。

       隨著TPD的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了一系列不依賴于募集E3泛素連接酶的創(chuàng)新策略，包括自噬系固化合物（ATTEC）、溶酶體靶向嵌合體（LYTAC）、自噬靶向嵌合體（AUTOTAC）、細胞因子受體靶向嵌合體（KineTAC）、整合素促進的溶酶體降解（IFLD）和樹突狀DNA嵌合體（DENTAC），已經(jīng)被開發(fā)出來，通過溶酶體運輸受體、生長吞噬體上的LC3-II或寡聚的SQSTM1來劫持內(nèi)源性溶酶體（圖1）。

       這些工具有效地降解細胞內(nèi)、細胞外和膜蛋白、蛋白質(zhì)聚集體、脂滴和受損的細胞器。此外，研究表明，病理蛋白可以直接被募集到26S蛋白酶體上，并受到小分子的誘導(dǎo)蛋白水解，例如最近開發(fā)的化學(xué)降解誘導(dǎo)劑（CIDEs）和泛素化獨立降解劑（uids）。

       在這里，我們概述了這些直接與溶酶體或蛋白酶體結(jié)合的TPD技術(shù)的最新發(fā)展[1]。

       圖1. 不依賴泛素化過程的TPD策略

       01通過自噬機制靶向降解細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細胞器

       自噬栓系化合物（attecs）

       最初的一種不依賴于泛素化的TPD方法被設(shè)計為利用LC3配體，在自噬的早期階段直接與發(fā)育中的吞噬細胞相互作用（圖2A），被稱為ATTEC，即一種自噬小體綁定化合物，其結(jié)構(gòu)包含靶蛋白配體、連接子、和LC3 配體三個部分。ATTEC分子可以直接將目標蛋白（POI）和自噬關(guān)鍵蛋白LC3結(jié)合在一起，促進目標蛋白通過自噬-溶酶體途徑降解[2]。

       復(fù)旦大學(xué)魯伯塤教授團隊開創(chuàng)性地提出了ATTEC的概念，報道了一系列可連接突變亨廷頓蛋白（mHTT）和LC3的分子膠化合物。

       實驗結(jié)果表明，這些化合物可以在細胞內(nèi)和動物模型體內(nèi)將mHTT靶向自噬體并降解 mHTT，而不影響野生型HTT的水平，還可以緩解亨廷頓病的相關(guān)表型[3]。

       靶向自噬嵌合體（AUTOTAC）

       2022年，Yong課題組首次提出AUTOTAC技術(shù)（圖2B）。AUTOTAC是一種異雙功能分子，一端為p62配體，另一端為靶蛋白配體，兩者通過Linker相連。具體作用機制如下：AUTOTAC與p62和靶蛋白同時結(jié)合，形成三元復(fù)合物，導(dǎo)致p62構(gòu)象發(fā)生變化，產(chǎn)生自身寡聚并暴露出LC3（light-chain 3）結(jié)合域，進而與LC3結(jié)合，介導(dǎo)底物隔離至自噬小體并通過溶酶體途徑降解。

       基于這一理念，研究人員開發(fā)出多種能夠激活p62的小分子化合物，并且在體外實驗中檢驗了它們降解可溶性蛋白的能力。實驗結(jié)果顯示，將直接激活p62的小分子化合物與靶向雄激素受體（AR）或雌激素受體β（ERβ）亞基的分子連接在一起，可以導(dǎo)致AR和ERβ通過自噬作用被降解，并且有效抑制它們介導(dǎo)的下游信號通路[4]。

       圖2.基于自噬的降解物的作用機制

       02通過內(nèi)溶酶體途徑靶向降解分泌蛋白和膜蛋白

       靶向溶酶體嵌合體（lytac）

       斯坦福大學(xué)的Bertozzi教授團隊報道了一種不同的蛋白降解技術(shù)——溶酶體靶向嵌合體（LYTACs），為靶向降解細胞外以及膜結(jié)合蛋白開辟了新的可能（圖3A）。

       研究人員報告稱，溶酶體靶向嵌合體（LYTACs）是一種雙功能分子，有兩個結(jié)合域，一端攜帶與細胞表面跨膜受體CI-M6PR結(jié)合的低聚糖肽基團，另一端攜帶一個與靶蛋白結(jié)合的抗體或小分子。這兩個結(jié)合域通過一個化學(xué)linker連接起來。

       后續(xù)經(jīng)研究人員證實，LYTAC技術(shù)能夠有效降解胞外蛋白和單次跨膜蛋白（如EGFR、PD-L1）[5]。

       整合素促進的溶酶體降解（IFLD）和樹突狀DNA嵌合體（DENTAC）

       細胞外和細胞膜相關(guān)蛋白占據(jù)了所有基因編碼蛋白質(zhì)的40%左右，其中部分蛋白是導(dǎo)致癌癥、衰老、代謝、免疫等多種疾病的關(guān)鍵因素，是一類重要的藥物作用靶點。

       為了實現(xiàn)此類蛋白的靶向降解，中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院房麗晶教授研究團隊發(fā)展了一種新型整合素促進的溶酶體降解（IFLD）策略（圖3B）。將靶蛋白結(jié)合配體與整合素識別配體相偶聯(lián)，所得到的雙功能化合物能夠以整合素和溶酶體依賴的方式誘導(dǎo)細胞外或細胞膜蛋白的內(nèi)吞和降解。整合素是細胞表面表達的細胞粘附受體，在細胞-基質(zhì)相互作用中發(fā)揮重要作用。由于整合素αvβ3通常在腫瘤中過表達，因此該IFLD策略在降解腫瘤相關(guān)蛋白方面極具價值。

       應(yīng)用這一策略，該團隊設(shè)計、合成了靶向免疫檢查點PD-L1的雙功能化合物BMS-L1-RGD，并證實該化合物在細胞和整體動物水平均能夠有效的降解靶標蛋白PD-L1，且具有顯著的體內(nèi)抗腫瘤效果[6]。

       此外，南京大學(xué)李金波教授團隊報告了一種樹突狀DNA嵌合體（DENTAC）策略（圖3C），該策略利用SRs進行靶向膜蛋白降解，包括POI結(jié)合分子與樹突狀DNA。DENTAC一端為靶蛋白配體，另一端為結(jié)合SR受體的樹枝狀DNA配體。DENTAC同時與靶蛋白和SR結(jié)合后可誘導(dǎo)靶蛋白溶酶體降解。共價樹枝狀DNA結(jié)構(gòu)明確，性質(zhì)穩(wěn)定，是SR的通用配體。

       研究發(fā)現(xiàn)DENTAC平臺可以利用SR介導(dǎo)致癌膜蛋白發(fā)生溶酶體途徑降解，達到治療腫瘤的目的[7]。

       細胞因子受體靶向嵌合體（KineTACs）

       美國加州大學(xué)舊金山分校James A. Wells團隊研究報道了一種溶酶體降解策略，稱為細胞因子受體靶向嵌合體（KineTACs）（圖3D），可用于定向降解細胞表面和細胞外蛋白。KineTAC是完全基因編碼的雙特異性抗體，由結(jié)合其同源細胞因子受體的細胞因子臂和目標蛋白質(zhì)的靶標結(jié)合臂組成。

       研究人員發(fā)現(xiàn)，含有細胞因子CXCL12的KineTAC可以使用誘餌回收受體CXCR7，將多種靶蛋白靶向到溶酶體進行降解。另外的KineTACs被設(shè)計用來駕馭其他CXCR7靶向細胞因子，CXCL11和vMIPII，以及白細胞介素-2（IL-2）受體靶向細胞因子IL-2。

       因此，KineTAC代表了一種通用的、模塊化的、選擇性的和簡單的遺傳編碼策略，用于誘導(dǎo)具有廣泛或組織特異性分布的細胞外和細胞表面靶標的溶酶體遞送[8]。

       圖3.利用配體觸發(fā)受體內(nèi)吞作用的基于溶酶體的降解物

       03通過直接募集26S蛋白酶體的TPD

       降解化學(xué)誘導(dǎo)劑（CIDEs）

       PROTAC分子依然面臨一系列挑戰(zhàn)：分子量過大而難以穿膜的困境；連接子的選擇有限，尚無系統(tǒng)標準的設(shè)計方法；脫靶毒性；E3連接酶的表達水平差異；POI可能不是所選E3連接酶的天然/理想底物等。

       有鑒于此，Erin C. Dueber等人提出希望拓展降解化學(xué)誘導(dǎo)劑（CIDEs）的選擇（圖4A），這就是直接將底物引向26S蛋白酶體。26S蛋白酶體在所有細胞都高表達，理論上可以擴展到任何底物；此外，這種策略使得降解端只需一種配體就足夠通用。機體本身也天然存在一些不依賴泛素化而直接被蛋白酶體降解的蛋白，如鳥氨酸脫羧酶和胸苷酸合酶[9]。

       研究人員通過實驗也證明了通過直接蛋白酶體募集進行降解是靶向蛋白質(zhì)降解的可行策略。

       ADRM1介導(dǎo)的泛素非依賴性降解物（UIDs）

       最近，Kodadek等人提出了一種基于直接參與26S蛋白酶體而不涉及多聚泛素鏈的替代TPD策略。UID系統(tǒng)使用26S蛋白酶體上的另一種泛素化受體ADRM1，由于不存在適合ADRM1的配體，因此使用穩(wěn)定過表達與HaloTag7融合的ADRM1 N端片段的細胞系作為模型系統(tǒng)，并將與底物靶向配體共軛的伯氯烷烴鏈作為同源UID化合物進行測試（圖4B），合成了靶向溴和外端結(jié)構(gòu)域（BET）家族蛋白的原型UID。

       研究發(fā)現(xiàn)，由ADRM1結(jié)合物和JQ1組成的異二價分子（ByeTACs）在納摩爾濃度范圍內(nèi)誘導(dǎo)了不依賴泛素化的蛋白酶體降解BRD4，他們也指出這些發(fā)現(xiàn)需要進一步驗證，但該研究表明目標蛋白募集到蛋白酶體可能足以有效降解[1]。

       圖4.直接與26S蛋白酶體結(jié)合的降解物

       總之，這些可替代的TPD方法不僅補充了用于細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的第一代PROTAC，而且還提供了靶向位于細胞膜和細胞外空間的病理蛋白質(zhì)獨特策略。