藥物研發(fā)新動向：靶向蛋白降解新型策略全盤點

       靶向蛋白降解技術(shù)利用真核細(xì)胞內(nèi)固有的兩大蛋白降解系統(tǒng)——泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）和溶酶體途徑，實現(xiàn)了多種疾病相關(guān)蛋白的靶向降解，正引領(lǐng)著下一代小分子藥物的發(fā)展方向。近年來，研究人員圍繞上述問題積極探索，開發(fā)了多維度的靶向蛋白降解技術(shù)。本文將盤點從2023年至今的靶向蛋白降解的新型策略，以供讀者參考。

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       基于納米平臺的

       靶向蛋白降解

       迄今為止，許多基于鄰近效應(yīng)的雙功能分子已經(jīng)被開發(fā)用于靶向調(diào)控生物大分子中，如靶向蛋白質(zhì)泛素化/磷酸化、靶向RNA降解等等。它們在分別接近兩個目標(biāo)分子后將其拉近，從而形成復(fù)合物而發(fā)揮下游功能。但這些雙功能分子往往是一價的，需要經(jīng)過復(fù)雜耗時的篩選和優(yōu)化。

       SM-PROTAC納米平臺

       2023年3月，北京大學(xué)深圳研究生院李子剛/尹豐團(tuán)隊開發(fā)了一種基于“分裂-混合”的納米平臺，并將其命名為split-and-mixPROTAC(SM-PROTAC)（圖1），他們將能夠自組裝的核心單體分別與PROTAC中的兩個組件（靶蛋白招募模塊和E3連接酶招募模塊）融合，以不同的比例將二者結(jié)合，再通過一些表征方法篩選二者的最 佳比例，同時該納米平臺的多價性質(zhì)也保證了目的蛋白的降解效果。之后，研究人員通過對一系列靶點的成功降解，證明了SM-PROTAC可以通過連接目標(biāo)蛋白配體和E3連接酶配體實現(xiàn)快速的靶標(biāo)蛋白降解以及配方優(yōu)化。

       同時，該平臺還具有極強的應(yīng)用潛力，可以擴展到任何生物分子，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)和其他生物分子的功能調(diào)控，如磷酸化/去磷酸化、泛素化、靶向降解、表觀遺傳學(xué)等。

       圖1. 基于“分裂和混合”的SM-PROTAC模型示意圖[1]

       LipoSM-PROTAC納米自調(diào)節(jié)平臺

       但是基于肽的SM-PROTAC的低藥效，限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。因此，迫切需要開發(fā)一種更有效的用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的PROTAC納米平臺。

       由于脂質(zhì)體具有易于配制、自動組裝和高負(fù)載運輸?shù)奶匦?。研究人員將SM-PROTAC與脂質(zhì)體結(jié)合，從而提出了一種基于脂質(zhì)體的分合（Split-and-Mix）納米自調(diào)節(jié)平臺(LipoSM-PROTAC)（圖2C），并對其進(jìn)行了生物學(xué)表征和驗證。研究發(fā)現(xiàn)，LipoSM-PROTAC系統(tǒng)具有葉酸選擇性降解靶標(biāo)蛋白的功能。且研究人員以雌激素受體蛋白（ERɑ）為模型，通過體外實驗驗證發(fā)現(xiàn)該體系具有顯著降解ERɑ蛋白的效果。

       與基于肽的SM-PROTAC相比，LipoSM-PROTAC系統(tǒng)可以以更低的濃度達(dá)到治療效果，并為臨床轉(zhuǎn)化提供了機會?？傮w而言，基于LipoSM的平臺顯示出更高的藥物功效，這為PROTAC和其他生物分子調(diào)控提供了潛在的應(yīng)用前景。

       圖2. 基于脂質(zhì)體的分合(Split-and-Mix)納米自調(diào)節(jié)平臺(LipoSM-PROTAC)模型示意圖[2]

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       針對特定細(xì)胞器內(nèi)蛋白的

       靶向蛋白降解

       目前，真核細(xì)胞中所有的靶向蛋白質(zhì)穩(wěn)定（TPD）都依賴于泛素蛋白酶體或溶酶體系統(tǒng)，因此對缺乏蛋白酶體和溶酶體的膜細(xì)胞器中的靶蛋白（如線粒體）無能為力。

       杭州醫(yī)學(xué)研究所的方曉紅團(tuán)隊設(shè)計并開發(fā)了一種線粒體蛋白酶靶向嵌合體（MtPTAC），用于實現(xiàn)線粒體基質(zhì)中蛋白的靶向降解（圖3）。MtPTAC是一種雙功能小分子，一端與線粒體酪蛋白水解蛋白酶P（ClpP）結(jié)合，另一端與靶蛋白結(jié)合，MtPTAC激活了ClpP的水解酶活性，同時使目標(biāo)蛋白與ClpP靠近，進(jìn)而水解掉靶蛋白。

       研究人員以線粒體RNA聚合酶（POLRMT）為靶蛋白，在體內(nèi)和體外均展示了MtPTAC強大的蛋白水解能力和抗腫瘤應(yīng)用前景。這是第一個模塊化設(shè)計的能夠特異性水解線粒體內(nèi)靶蛋白的TPD。

       圖3. 線粒體蛋白酶靶向嵌合體(MtPTAC)模型示意圖[3]

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       可逆的蛋白靶向降解嵌合體

       對于傳統(tǒng)的PROTAC分子而言，其使用的過程中往往會表現(xiàn)出鉤狀效應(yīng)，即當(dāng)PROTAC分子的濃度達(dá)到某一特定值后，進(jìn)一步增加其濃度反而會降低靶蛋白的降解效率，而這一效應(yīng)也在一定程度上限制了PROTAC分子在活體和臨床研究中的應(yīng)用。

       基于這一背景，佛羅里達(dá)大學(xué)的Thomas Kodadek教授和來自康奈爾大學(xué)的Francis Barany教授團(tuán)隊提出了一種自組裝蛋白降解靶向嵌合體（SAPTAC）的設(shè)計策略（圖4），將PROTAC分子拆分為與靶蛋白和E3泛素連接酶結(jié)合的兩部分（用于實現(xiàn)可逆耦合的“X和Y”），如果在平衡狀態(tài)下，存在大量未連接的目標(biāo)蛋白和E3連接酶配體，這些低分子量分子可以比穩(wěn)定連接的PROTAC更有效地滲透細(xì)胞/組織。在滲透細(xì)胞后，目標(biāo)蛋白和E3連接酶之間將形成共價可逆結(jié)構(gòu)，引向關(guān)鍵的三元復(fù)合物，觸發(fā)目標(biāo)蛋白的多泛素化和隨后的蛋白酶體介導(dǎo)的破壞，從而實現(xiàn)消除鉤狀效應(yīng)。

       圖4. 自組裝蛋白降解靶向嵌合體(SAPTAC)模型示意圖[4]

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       基于非傳統(tǒng)降解途徑的

       靶向蛋白質(zhì)降解

       在哺乳動物受到多種刺激后，可激活早期基因（IEG），IEG介導(dǎo)生長因子、神經(jīng)元和免疫刺激的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，編碼Fos、EGR和NR4A家族的轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)遲發(fā)反應(yīng)基因（LRG）的轉(zhuǎn)表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞對刺激作出響應(yīng)。而LRG具有細(xì)胞反應(yīng)特異性，在對首次刺激的適應(yīng)性反應(yīng)中至關(guān)重要，IEG mRNA在首次刺激后的幾分鐘內(nèi)積累，一旦翻譯，它們的蛋白質(zhì)會迅速降解，從而出現(xiàn)蛋白質(zhì)瞬時爆發(fā)式表達(dá)，促使細(xì)胞對各種刺激產(chǎn)生適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)。

       盡管IEG的轉(zhuǎn)錄機制得到了很好的研究，但I(xiàn)EG蛋白的降解機制仍然是個謎。為了表征IEG蛋白的降解機制，Michael E. Greenberg和Stephen J. Elledge團(tuán)隊通過全局蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析（GPS）系統(tǒng)來測定IEG蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，并進(jìn)行全基因組CRISPR-Cas9篩選，以尋找那些調(diào)節(jié)IEG蛋白穩(wěn)定性的基因（圖2）。

       他們發(fā)現(xiàn)，midnolin蛋白是哺乳動物中一種未被充分表征的蛋白質(zhì)，它的過表達(dá)促進(jìn)c-Fos、FosB、EGR1和NR4A1等多種IEG蛋白的蛋白酶體降解，抑制蛋白酶體的活性而不是抑制泛素化酶的活性可抑制IEG蛋白降解，表明IEG蛋白降解依賴于midnolin和蛋白酶體，而不是泛素化降解途徑。midnolin-蛋白酶體途徑可能代表了蛋白酶體繞過經(jīng)典泛素化途徑，以實現(xiàn)核蛋白選擇性降解的一般機制。

       圖5. midnolin-蛋白酶體途徑獨立于泛素化降解許多核蛋白[5]

       O-糖基化是真核生物中最普遍的糖基化形式。在多種類型的O-糖基化蛋白中，最突出的是黏蛋白（mucins），它主要由上皮細(xì)胞分泌，在一系列類型的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，并通過調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性誘導(dǎo)各種致癌信號分子促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

       黏蛋白酶StcE是一種選擇性切割黏蛋白的蛋白酶。StcE可以選擇性地從生物樣品中去除黏液結(jié)構(gòu)域糖蛋白，并將其切割成片段，便于分析。StcE對黏蛋白表現(xiàn)出基于肽和聚糖的選擇性。斯坦福大學(xué)的Carolyn R. Bertozzi教授團(tuán)隊通過納米抗體將StcE酶靶向到癌細(xì)胞表面，并通過酶工程化改造降低StcE酶的酶活性，從而僅在癌細(xì)胞表面富集的情況下完成降解過程，避免誤傷健康細(xì)胞的黏蛋白，具有腫瘤治療的前景（圖6）。

       圖6. ColabFold (Methods)62預(yù)測的納米體-黏液酶偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)[6]

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       通過分子內(nèi)二價膠

       進(jìn)行靶向降解

       IBG1是專利報道的一個類PROTAC的降解劑，其是由BET抑制劑JQ1和DCAF15的芳基磺酰胺配體E7820連接而成，能夠在多個細(xì)胞系中誘導(dǎo)BRD4的高效降解。實驗結(jié)果表明，IBG1誘導(dǎo)的BRD4降解依賴于蛋白酶體途徑，但與DCAF15無關(guān)。

       英國鄧迪大學(xué)的Ciulli團(tuán)隊與奧地利科學(xué)院CeMM分子醫(yī)學(xué)研究中心的Winter團(tuán)隊通過研究IBG1分子對BRD4的靶向降解機制，揭示了IBG1是一種分子內(nèi)二價膠水，并發(fā)現(xiàn)了一種新型的靶蛋白降解模式，即小分子同時順式（cis）結(jié)合靶蛋白的兩個相鄰結(jié)構(gòu)域，靶蛋白構(gòu)象的變化使其粘連到E3連接酶上，與一般的PROTAC等反式（trans）蛋白-連接酶結(jié)合有著本質(zhì)的區(qū)別。

       這種兩個結(jié)構(gòu)域的分子內(nèi)二聚化修飾蛋白質(zhì)表面并調(diào)節(jié)蛋白-蛋白相互作用的方法，是一種高效靶向蛋白質(zhì)降解的新策略（圖7），為藥理學(xué)的發(fā)展提供了新的設(shè)計方向。

       圖7. 傳統(tǒng)的一價膠和二價PROTACs與分子內(nèi)二價膠分子識別模式的示意圖模型[7]