靶向“不可成藥”靶點，淺析PROTAC、分子膠靶向蛋白降解與靶向蛋白穩(wěn)定技術(shù)

       靶向蛋白降解（Targeted protein degradation, TPD）在過去二十年中作為一種主要的新型藥物模式已被廣泛用于多種蛋白，為癌癥、炎癥等疾病治療提供了一種潛在的有前途的治療策略。

       其中，蛋白降解靶向嵌合體（Proteolysis targeting chimeras，PROTAC）作為一種有潛力的靶向蛋白降解技術(shù)，它是具有E3泛素連接酶招募者與感興趣蛋白（POI）配體連接的異雙功能小分子，通過誘導(dǎo)E3泛素連接酶與POI靠近實現(xiàn)靶蛋白降解。PROTAC分子具有高效、低耐藥性等特點，同時能靶向“不可成藥”蛋白，其應(yīng)用前景十分廣泛。

       之后，受PROTAC的啟發(fā)，去泛素化酶靶向嵌合體（deubiquitinase-targeting chimeras，DUBTACs）成功問世，用于靶向蛋白質(zhì)穩(wěn)定（targeted protein stabilization，TPS）。接下來，我們就來重點介紹一下靶向蛋白降解技術(shù)和靶向蛋白穩(wěn)定技術(shù)（圖1）。

       圖1. 靶向蛋白降解技術(shù)和靶向蛋白穩(wěn)定技術(shù)作用機制示意圖

       01

       細胞內(nèi)靶向蛋白降解(iTPD)

       近年來，細胞內(nèi)靶向蛋白降解（intracellular targeted protein degradation，iTPD）已成為小分子藥物新的重要模式（圖2）。在這里，構(gòu)建了異雙功能小分子，招募感興趣的藥物靶蛋白（POI）和E3連接酶，用于蛋白酶體降解。目前，已經(jīng)開發(fā)出兩類這樣的分子。

       PROTAC

       蛋白質(zhì)水解靶向嵌合體（Proteolysis-targeting chimeras, PROTACs）由Crews和Deshaies團隊首 創(chuàng)，是由一個linker連接的大的特異性小分子；一部分與POI結(jié)合，另一部分與E3連接酶結(jié)合，使POI泛素化，被細胞質(zhì)中的蛋白酶體降解。

       分子膠

       第二類被稱為分子膠，是利用小分子化合物通過非共價作用與病理蛋白結(jié)合，形成大的穩(wěn)定復(fù)合物，阻止病理蛋白的功能。在這種情況下，分子膠增強了E3連接酶和POI之間的相互作用，導(dǎo)致其泛素化和降解。相關(guān)文章回顧：繼PROTAC之后的新型蛋白降解劑：分子膠。

       由于PROTAC與E3連接酶和POI具有獨立的結(jié)合位點，因此比分子膠更容易設(shè)計。然而，它們通常是大分子，開發(fā)起來很有挑戰(zhàn)性，而基于lipinski五規(guī)則等指導(dǎo)原則，分子膠通常更小，更像藥物。值得注意的是，雷帕霉素、FK506和環(huán)孢菌素等天然產(chǎn)物膠都是較大的分子，但仍可口服生物利用，它們代表了臨床使用的分子膠的很大一部分。

       圖2. 細胞內(nèi)靶向蛋白降解(iTPD)示意圖

       與傳統(tǒng)的基于“占位驅(qū)動”的小分子抑制劑相比，iTPD具有顯著的優(yōu)勢。

       首先，PROTACs發(fā)揮作用取決于靶蛋白和E3連接酶的空間鄰近，屬于“事件驅(qū)動”的作用模式。PROTAC具有催化特性，只需提供與靶蛋白的結(jié)合活性，無須直接占據(jù)靶蛋白的活性口袋、有助于攻克小分子難以成藥的靶點。

       其次，PROTAC發(fā)揮作用時直接將靶蛋白降解，克服了傳統(tǒng)小分子藥物容易導(dǎo)致的靶蛋白過表達及突變等耐藥性問題。

       第三，由于PROTAC的生效機制類似催化反應(yīng)，因此只需要極低劑量即可發(fā)揮效用，較低的給藥濃度使PROTAC藥物的安全性較高。

       目前，已有ARV-110、ARV-471、KT-474和DT2216等多個PROTAC分子進入臨床試驗階段。與PROTAC相比，分子膠有更小的分子量（通常小于600Da）、更好的膜通透性和成藥性，但分子膠并不等同于“去掉連接子的PROTAC”。分子膠通過誘導(dǎo)或穩(wěn)定E3連接酶與靶蛋白之間的“蛋白-蛋白相互作用”（protein?protein interaction，PPI），介導(dǎo)靶蛋白泛素化和隨后的蛋白酶體降解。

       分子膠的發(fā)現(xiàn)多是偶然的，最 具代表性的是IKZF1/3降解劑沙利度胺、來那度胺和泊馬度胺。在此基礎(chǔ)上，研究人員通過合理的結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到了CC-92480（IKZF1/3降解劑）和CC-90009（GSPT1降解劑）等進入臨床試驗階段的分子膠（圖3）。

       圖3. 分子膠與PROTAC的作用方式及結(jié)構(gòu)特點

       02

       細胞外靶向蛋白降解(eTPD)

       細胞外蛋白質(zhì)組由分泌蛋白和膜結(jié)合蛋白組成，涵蓋了生長因子、細胞因子、激素、酶和受體等多種蛋白質(zhì)，它們在細胞信號傳導(dǎo)、免疫反應(yīng)、組織修復(fù)和新陳代謝中扮演重要角色。由于許多疾病與細胞外蛋白的失調(diào)有關(guān)，因此，細胞外蛋白質(zhì)被認為是藥物研發(fā)中的一類重要治療靶點。

       近年來，細胞外靶向蛋白降解（extracellular targeted protein degradation，eTPD）技術(shù)的出現(xiàn)，為研究人員提供了一種全新的模式來調(diào)節(jié)細胞外蛋白質(zhì)組。不同于傳統(tǒng)基于“占位驅(qū)動”的藥物，eTPD技術(shù)運用雙特異性生物制劑或小分子招募細胞外蛋白，將細胞外蛋白質(zhì)運送到溶酶體進行選擇性降解，這種獨特的作用方式拓展了可治療的靶點范圍，為治療多種疾病開辟了新的可能性（圖4）。

       圖4. 細胞外靶向蛋白降解(eTPD)示意圖

       目前，降解細胞外蛋白質(zhì)主要有六種不同的方法策略，分別是降解可溶性POI的清除抗體eTPD、基于聚糖的循環(huán)受體eTPD、基于跨膜E3連接酶靶向膜蛋白的eTPD、基于細胞因子靶向膜蛋白的eTPD、基于整合素的eTPD、從內(nèi)部降解膜蛋白的eTPD。

       NO.1

       降解可溶性POI的清除抗體eTPD

       降解可溶性POI的清除抗體eTPD是“清除抗體”（sweeping antibodies）分子經(jīng)過工程改造，增強了它們與Fc回收受體、新生兒Fc受體（FcRn）或FcγRIIb的結(jié)合能力?？梢允构こ袒贵w通過FcRn，以pH可切換的方式將POI遞送到酸性內(nèi)體，酸性內(nèi)體釋放POI進行溶酶體降解。

       Tocilizumab（Tcz）是一種被批準用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的人源化抗體。pH可切換的Tocilizumab于2020年被批準用于治療視神經(jīng)脊髓炎譜系障礙，這代表了eTPD中第一個被批準的抗體。

       NO.2

       基于聚糖的循環(huán)受體eTPD

       基于聚糖靶向的再循環(huán)受體，如陽離子非依賴性甘露糖6-磷酸受體（CI-M6PR）可以促進膜和可溶性POI的溶酶體降解。其中，溶酶體靶向嵌合體（LYTAC）就是利用LYTAC–POI復(fù)合物與CI-M6PR結(jié)合后被內(nèi)化，導(dǎo)致POI在溶酶體中降解。

       NO.3

       基于跨膜E3連接酶靶向膜蛋白的eTPD

       基于跨膜E3連接酶靶向膜蛋白的eTPD是利用靶向含有跨膜結(jié)構(gòu)域的E3連接酶家族成員和POI的雙特異性抗體降解靶蛋白，被稱為AbTACs或PROTAB。

       NO.4

       基于細胞因子靶向膜蛋白的eTPD

       基于細胞因子靶向膜蛋白的eTPD，如細胞因子受體靶向嵌合體（KineTAC）也是一種雙特異性抗體，KineTAC一端結(jié)合細胞因子或生長因子，而另一端結(jié)合POI。從而實現(xiàn)膜結(jié)合型和可溶性蛋白的降解。

       NO.5

       基于整合素的eTPD

       利用整合素促進的溶酶體降解技術(shù)是使用雙特異性抗體的一端結(jié)合整合素，而另一端結(jié)合POI，從而將POI引導(dǎo)至溶酶體進行降解，同時利用整合素的循環(huán)能力來增強目標定位和效率。

       NO.6

       從內(nèi)部降解膜蛋白的eTPD

       從內(nèi)部降解膜蛋白的eTPD則涉及PROTACs技術(shù)，這類分子一部分用于結(jié)合受體酪氨酸激酶的細胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域，而另一部分與細胞質(zhì)中的E3連接酶結(jié)合，通過泛素蛋白酶體途徑進行降解。PROTACs技術(shù)為靶向細胞內(nèi)蛋白質(zhì)提供了一種高效的降解策略（圖5）。

       圖5. 降解細胞外蛋白質(zhì)的六種不同方法策略

       03

       靶向蛋白穩(wěn)定（TPS）

       2022年初，美國加州大學(xué)伯克利分校的Daniel Nomura教授團隊與諾華生物醫(yī)學(xué)研究所（NIBR）的研究人員合作，開發(fā)了一種新的治療模式，它被稱為去泛素化酶靶向嵌合體（Deubiquitinase Targeting Chimera ，DUBTACs）。

       DUBTACs是一種異雙功能小分子，由一個與蛋白質(zhì)靶向配體和去泛素化酶招募者組成，DUBTACs發(fā)揮作用的大致過程為：DUBTACs一端結(jié)合靶蛋白（POI），一端結(jié)合去泛素化酶，誘導(dǎo)靶蛋白與去泛素化酶的靠近，從而去除泛素鏈，以阻止蛋白酶體介導(dǎo)的靶蛋白的降解，達到穩(wěn)定以泛素依賴方式降解的特定蛋白質(zhì)的水平（圖6）。

       在這項研究中，研究人員利用DUBTACs，提高了一種名為CFTR的氯離子通道蛋白突變體的穩(wěn)定性。通常這種突變體的降解，會導(dǎo)致嚴重的囊性纖維化（CF）疾病。研究結(jié)果顯示，靶向CFTR的DUBTACs，能夠恢復(fù)從囊性纖維化患者體內(nèi)獲得的原代人類支氣管上皮細胞的氯離子通道功能。研究結(jié)果同時顯示，DUBTACs可以被用于治療癌癥。他們開發(fā)了一款能夠穩(wěn)定腫瘤抑制蛋白WEE1激酶的DUBTAC。WEE1激酶在很多腫瘤中被主動降解，從而促進癌細胞的增生，穩(wěn)定癌細胞中WEE1激酶的水平可能終止腫瘤的生長。

       不久后，美國哈佛醫(yī)學(xué)院的魏文毅教授團隊和西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院的金堅教授團隊，使用EN523招募去泛化素酶OTUB1進一步開發(fā)了能夠穩(wěn)定抑癌蛋白的首 個TF-DUBTAC藥物平臺，旨在通過穩(wěn)定抑癌轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factor，TF）實現(xiàn)對腫瘤的治療。

       圖6. DUBTACs作用示意圖

       總體來說，DUBTACs作為一種較新的療法，進行的研究和開發(fā)還相對較少，但也已經(jīng)在某些特定的案例中展現(xiàn)出了治療潛力，TPD和TPS的興起代表了藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域的一次重大突破。鑒于其在癌癥治療、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)退行性疾病以及傳染病等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，TPD和TPS正顯現(xiàn)出作為一種多功能性治療策略的廣泛意義。