肽核酸（PNA）知多少？

       肽核酸（PNA，Peptide Nucleic Acid）是一種人工合成的類似于DNA或RNA的聚合物。PNA可以說是誕生在丹麥的化合物，它最初由 Peter E. Nielsen（哥本哈根大學）、Michael Egholm（哥本哈根大學）、Rolf H. Berg（Risø 國家實驗室，丹麥科技大學）和 Ole Buchardt（哥本哈根大學）于 1991 年發(fā)明。

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PNA的化學結(jié)構(gòu)

       DNA 和 RNA 的分子骨架是由交替的核糖（脫氧核糖）和磷酸通過磷酸二酯鍵連接在一起的。與核酸不同，PNA的主鏈是由重復 N-(2-氨基乙基)-甘氨酸單元（圖1）通過肽鍵（酰胺鍵）搭建而成的（圖2 藍色部分）。相同的是，它們都包含有側(cè)鏈的核堿基（nucleobase）。在PNA分子中，各種嘌呤和嘧啶堿基（圖2紅色部分）通過乙酰結(jié)構(gòu)（圖2綠色部分）與主鏈上甘氨酸部分的N融合。

       可以說PNA結(jié)合了兩個截然不同的大分子特征：肽和核酸。從整體來看，PNA像是包含堿基側(cè)鏈的聚N-(2-氨基乙基)-甘氨酸多肽。

圖1. N-(2-氨基乙基)-甘氨酸化學結(jié)構(gòu)

       如果堿基序列互補，則PNA可以與 DNA 鏈之間產(chǎn)生結(jié)合作用。PNA 側(cè)鏈的堿基可以與雙鏈RNA或DNA雙螺旋主溝的堿基之間形成氫鍵，從而與雙鏈 RNA 或 DNA 的外部結(jié)合。這種所謂的 Hoogsteen 配對產(chǎn)生了三重螺旋。由于 PNA 的主鏈不包含帶負電的磷酸二酯基團，因此由于缺乏靜電排斥，因此PNA與DNA 鏈之間的結(jié)合比 DNA與DNA 鏈之間的結(jié)合更強。PNA甚至還可以破壞DNA雙鏈之間的結(jié)合，從而插入DNA雙鏈中間。但缺少電荷的事實也使PNA相當疏水，這使得它很難以溶液形式輸送到體細胞。

圖2. PNA與DNA (單鏈) 化學結(jié)構(gòu)。

       PNA的化學修飾

       PNA的特性使得這類化合物成為反義藥物的理想選擇，因為PNA可以通過結(jié)合 mRNA 來抑制蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。從理論上講，PNA 可以比當今開發(fā)的大多數(shù)反義藥物（通常是 DNA 或 RNA 片段）結(jié)合得更牢固。

圖3. γ-PNA化學結(jié)構(gòu)

       第一代 PNA 不溶于水，因此這些分子很容易在溶液中聚集，并與細胞中的其他生物聚合物產(chǎn)生非特異性結(jié)合，從而導致毒性。這一問題通過γ-PNA的分子設計得到了解決。通過將羥甲基引入PNA主鏈上N-(2-氨基乙基)-甘氨酸單元上的Cγ（圖3）。修飾后的 γ-PNA與DNA 和 RNA 更有效地結(jié)合。與未修飾的 PNA相比，γ-PNA 與DNA的結(jié)合更加穩(wěn)定。除此之外，PNA不會像合成 DNA 或 RNA 那樣被核酸酶和蛋白酶降解，這種特性賦予它們更好的穩(wěn)定性。除了羥甲基之外，研究人員還在在肽骨架上添加二甘醇側(cè)鏈，以此增加 PNA 的結(jié)合強度并增加改性PNA的溶解度。這些化學修飾PNA可以解決PNA候選藥物遞送至靶細胞的問題。

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PNA的應用

       PNA的應用包括改變基因表達，可以作為抑制劑和啟動子、反基因和反義治療劑、抗癌劑、抗病毒劑、抗菌劑和抗寄生蟲劑、生物傳感器的分子工具和探針、DNA 序列檢測和納米技術。

       基因組編輯

       2022 年 10 月，Neubase將其 PNA 業(yè)務的重點轉(zhuǎn)向基因編輯上。Neubase 與一家全球醫(yī)療保健公司合作，計劃創(chuàng)建 PNA，旨在編輯三種未公開疾病的基因突變。異常的核酸結(jié)構(gòu)是內(nèi)源性修復的關鍵，可能發(fā)生在序列特定的條件下。PNA能夠?qū)崿F(xiàn)非酶促基因編輯。該方法利用了 Nielson 于 1991 年發(fā)現(xiàn)的 PNA 侵入和撬開雙鏈 DNA 分子的能力。通過在基因組內(nèi)形成高親和力的異源雙鏈或三鏈體結(jié)構(gòu)，PNA 已被用于糾正多種人類疾病相關突變，且脫靶效應較低。分子設計、化學修飾和遞送方面的進步使 PNA 的系統(tǒng)性體內(nèi)應用成為可能，從而在臨床前小鼠模型中實現(xiàn)基因編輯。在 β-地中海貧血模型中，經(jīng)過治療的動物表現(xiàn)出臨床相關的蛋白質(zhì)恢復和疾病表型改善，表明 PNA 具有治療性應用治療單基因疾病的潛力。

       核酸傳感

       特定核酸序列的檢測在生物醫(yī)學研究和診斷中至關重要。PNA 獨特的雜交特性和代謝穩(wěn)定性使其非常適合在復雜的生物環(huán)境甚至整個細胞中進行傳感。 活細胞成像的主要策略之一是使用熒光探針，并在雙鏈體復合物形成時增加熒光。這一技術已經(jīng)應用于檢測 KRAS 致癌突變 (SNP)。熒光PNA 探針的用途也已擴展到三鏈體的檢測。

       超分子藥物

       在過去十年中，許多研究使用 PNA―配體偶聯(lián)物，將其自組裝為更大的結(jié)構(gòu)。已發(fā)現(xiàn) PNA―配體偶聯(lián)物的組裝體在體內(nèi)具有活性功能。 例如靶向 αvβ3 整合素（一種在許多癌癥中過度表達的三聚體受體）的 PNA―配體偶聯(lián)物在寡聚化時顯示出 100 倍的增強結(jié)合，導致小鼠模型中的腫瘤集落減少 50%。PNA 標記的大分子已被用于編程抗體片段 (Fab)，以快速探索雙特異性抗體。

       反義治療劑

       PNA 的代謝穩(wěn)定性和強結(jié)合親和力使其成為反基因治療的可利用工具。PNA 是空間阻滯劑，通過與起始位點結(jié)合來抑制靶 mRNA 的剪接或翻譯。在 C 末端用四個賴氨酸修飾的 PNA分子，被證實可有效糾正轉(zhuǎn)基因小鼠的異常剪接，顯示出其作為治療劑的潛力。 在另一項研究中，GPNA（α-胍基修飾PNAs） 成功地用于抑制小鼠模型中 EGFR 的表達，EGFR 是非小細胞肺癌的重要驅(qū)動因素。

       PNA治療劑

       PNA 的主要候選藥物使用直接的反義方法。韓國制藥公司 OliPass在這方面具有領先優(yōu)勢，其最 先進的候選藥物止痛藥 OLP-1002 正在進行臨床試驗。Olipass 的 PNA 用含有陽離子脂質(zhì)基團的堿基進行修飾，可提高穩(wěn)定性并易于進入細胞。這使得它們在低至 10 ng/kg 的劑量下在動物模型中具有活性，比現(xiàn)有的反義寡核苷酸低許多數(shù)量級。 PNA 可以進入細胞核，并與前體 mRNA 相互作用。前體 mRNA 是在剪接酶切除不需要的部分之前，通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的第一個 mRNA 版本。通過與這些前體mRNA 分子結(jié)合，PNA 從根本上防止剪接酶清理 RNA 代碼，導致 mRNA 無法正確翻譯，從而阻止蛋白質(zhì)生產(chǎn)。

       第二家利用 PNA 技術的公司是總部位于匹茲堡的 Neubase Therapeutics。該公司目前擁有針對三種疾病的 PNA 候選藥物。他們最 先進的候選藥物 NT-0200 針對 1 型強直性肌營養(yǎng)不良癥，這是一種由錯誤的 RNA 引起的進行性肌肉疾病，它會捕獲關鍵的剪接蛋白并導致細胞翻譯錯誤。根據(jù) Neubase 的小鼠研究，NT-0200 可恢復廣泛組織的下游蛋白質(zhì)生產(chǎn)。該公司還有一種 PNA 候選藥物，它在轉(zhuǎn)錄成 mRNA 后靶向亨廷頓基因的重復三核苷酸序列。

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總結(jié)

       幾種 PNA 藥物正在進行臨床試驗，其他藥物正在開發(fā)中。開發(fā)可行的 PNA 療法的道路一直很艱難。學術界和初創(chuàng)企業(yè)的科學家們對 PNA 骨架的化學調(diào)整，使分子更容易潛入細胞并更牢固地鎖定 RNA 以沉默基因。在開發(fā)這些療法的同時，化學家現(xiàn)在能夠利用 PNA 嵌入DNA 螺旋的能力，使其成為基因編輯的理想工具，并成為突破性 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的潛在替代品。盡管 CRISPR 有十年的領先優(yōu)勢，但現(xiàn)在有幾種使用 PNA 的基因編輯方法正在研究開發(fā)之中。雖然PNA的技術目前可以說尚未修成正果，但距離它們正式登上醫(yī)藥舞臺的時間應該不會太遠了。

       參考資料：

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