mRNA疫苗的技術(shù)創(chuàng)新和研究進(jìn)展

       疫苗是預(yù)防傳染性疾病傳播的最有效的公共衛(wèi)生干預(yù)措施。成功的疫苗接種根除了許多威脅生命的疾病，如天花和脊髓灰質(zhì)炎，世界衛(wèi)生組織估計(jì)疫苗每年可防止200-300萬人死于破傷風(fēng)、百日咳、流感和麻疹。然而，盡管常規(guī)疫苗取得了明顯的成功，但它們并不能有效對付瘧原蟲、丙型肝炎和HIV等逃避免疫監(jiān)視的病原體。此外，它們需要定期修改以應(yīng)對快速變異的病原體，如流感病毒。

       基于mRNA的核酸疫苗是在30多年前提出的，希望能產(chǎn)生安全、多功能、易于生產(chǎn)的疫苗。mRNA疫苗比傳統(tǒng)疫苗有許多優(yōu)點(diǎn)：與某些病毒疫苗不同，mRNA不會(huì)整合到基因組中，從而避免了對插入突變的擔(dān)憂；mRNA疫苗可以以無細(xì)胞的方式制造，從而實(shí)現(xiàn)快速、經(jīng)濟(jì)、高效的生產(chǎn)。此外，單個(gè)mRNA疫苗可以編碼多種抗原，增強(qiáng)針對適應(yīng)性病原體的免疫反應(yīng)，并能夠以單一配方針對多種微生物或病毒變體。

       最初，由于擔(dān)心其穩(wěn)定性、低效性和過度免疫刺激，mRNA治療并沒有得到重視。然而在過去的十年中，mRNA治療領(lǐng)域日新月異，包括mRNA藥理學(xué)的深入研究，有效載體的開發(fā)和mRNA免疫原性的控制，使得mRNA疫苗的臨床應(yīng)用進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段。

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       mRNA的設(shè)計(jì)與合成

       體外轉(zhuǎn)錄（IVT）mRNA模擬內(nèi)源性mRNA的結(jié)構(gòu)，有五個(gè)部分，從5?到3?包括：5?cap，5?非翻譯區(qū)（UTR），一個(gè)編碼抗原的開放閱讀框，3?UTR和一個(gè)PolyA尾。

       與天然真核mRNAs一樣，5′端帽結(jié)構(gòu)包含一個(gè)7-甲基鳥苷核苷，5′端結(jié)構(gòu)會(huì)在空間上保護(hù)mRNA不被核酸外切酶降解，并與翻譯起始因子蛋白協(xié)同工作，招募核糖體以啟動(dòng)翻譯。PolyA尾的長度間接調(diào)節(jié)mRNA翻譯和半衰期。

       編碼區(qū)兩側(cè)的5′和3′UTR調(diào)節(jié)mRNA翻譯、半衰期和亞細(xì)胞定位，來自高表達(dá)基因（如α-和β-珠蛋白基因）的天然UTR是合成mRNAs的首選。此外，UTR可根據(jù)細(xì)胞類型進(jìn)行優(yōu)化，如通過去除3′UTR中的miRNA結(jié)合位點(diǎn)和富含AU的區(qū)域，將mRNA降解降至最低。

       mRNA疫苗的開放閱讀框是最關(guān)鍵的組成部分，盡管開放閱讀框不像非編碼區(qū)那樣具有可塑性，但可以通過優(yōu)化密碼子，從而在不改變蛋白質(zhì)序列的情況下增加翻譯。例如，CureVac AG公司發(fā)現(xiàn)人類mRNA密碼子很少在第三位有A或U，從而用G或C替換開放閱讀框第三位的A或U。并將此優(yōu)化策略用于其SARS-CoV-2疫苗CVnCoV，目前正處于III期試驗(yàn)階段。

       為了最大化翻譯，mRNA序列通常包含修飾的核苷，例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷類似物。修飾核苷的使用，特別是修飾尿苷，阻止了模式識(shí)別受體的識(shí)別，保證了翻譯過程產(chǎn)生足夠水平的蛋白質(zhì)。Moderna和Pfizer–BioNTech SARS-CoV-2疫苗都含有核苷修飾。另一種避免模式識(shí)別受體檢測的策略，由CureVac首 創(chuàng)，使用序列工程化和密碼子優(yōu)化，通過提高疫苗mRNA的GC含量來消耗尿苷。

       除了mRNA序列的改進(jìn)外，在簡化mRNA生產(chǎn)方面也取得了重大進(jìn)展。臨床上使用的合成mRNA通過使用噬菌體RNA聚合酶T7（也可以使用T3和SP6聚合酶）從DNA質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)錄。另外，使用CleanCap的共轉(zhuǎn)錄封蓋技術(shù)，簡化了純化步驟。

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       mRNA疫苗的載體

       由于mRNA較大（104–106Da）且?guī)ж?fù)電，因此無法通過細(xì)胞膜的陰離子脂質(zhì)雙層。此外，在體內(nèi)，它會(huì)被先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞吞噬，并被核酸酶降解。因此，體內(nèi)應(yīng)用需要使用mRNA遞送載體，該載體轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞而不會(huì)引起毒性或不必要的免疫原性。目前，已經(jīng)為此開發(fā)了許多基于創(chuàng)新材料的解決方案。

       1.脂質(zhì)納米顆粒（LNP）

       脂質(zhì)納米顆粒是臨床上最 先進(jìn)的mRNA載體。截至2021年6月，所有正在研制或批準(zhǔn)臨床使用的SARS-CoV-2 mRNA疫苗均采用LNPs。LNP為mRNA遞送提供了許多好處，包括制劑簡單、模塊化、生物相容性和較大的mRNA有效載荷容量。除RNA藥物外，LNP通常包括四種成分，可電離脂質(zhì)、膽固醇、輔助磷脂和聚乙二醇化脂質(zhì)，它們共同封裝和保護(hù)脆弱的mRNA。

       可電離脂質(zhì)與mRNA在酸性緩沖液中形成納米顆粒，使脂質(zhì)帶正電荷并吸引RNA。此外，它們在內(nèi)涵體的酸性環(huán)境中帶正電荷，這促進(jìn)了它們與內(nèi)涵體膜的融合，將其釋放到細(xì)胞質(zhì)中。

       DODAP和DODMA是第一種用于RNA輸送的可電離脂質(zhì)。通過設(shè)計(jì)提高DODMA的功效，產(chǎn)生了DLin-MC3-DMA。這是第一個(gè)FDA批準(zhǔn)的藥物制劑中使用的可電離脂質(zhì)：siRNA藥物patisiran（Onpattro）。除了有效且安全地遞送siRNA外，DLin-MC3-DMA還用于mRNA的遞送。

       目前，學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的許多團(tuán)體使用組合反應(yīng)方案來合成潛在的傳遞材料，這種方法產(chǎn)生了許多有效的脂質(zhì)，包括C12-200、503O13、306Oi10、OF-02、TT3、5A2-SC8、SM-102（用于抗SARS-CoV-2的Moderna疫苗mRNA-1273）和ALC-0315（用于輝瑞疫苗BNT162b2）。

       除了尋求提高療效外，人們越來越關(guān)注提高藥物的特異性，特別是對疫苗和免疫療法的特異性。含有多環(huán)金剛烷尾的脂質(zhì)11-A-M58，和含有環(huán)咪唑頭的脂質(zhì)93-O17S59，已被設(shè)計(jì)用于體內(nèi)靶向T細(xì)胞。盡管機(jī)制尚不清楚，但這些脂質(zhì)的環(huán)狀基團(tuán)對于靶向T細(xì)胞至關(guān)重要。

       盡管電離脂質(zhì)可以說是LNP最重要的成分，但其他三種脂質(zhì)成分（膽固醇、輔助脂質(zhì)和聚乙二醇化脂質(zhì)）也促進(jìn)了納米粒子的形成和功能。膽固醇是一種天然存在的脂質(zhì)，它通過填充脂質(zhì)之間的空隙來增強(qiáng)納米顆粒的穩(wěn)定性，并有助于在攝取到細(xì)胞的過程中與內(nèi)涵體膜融合。

       輔助脂質(zhì)通過促進(jìn)有助于膜與內(nèi)涵體融合的脂質(zhì)相變來調(diào)節(jié)納米顆粒的流動(dòng)性并增強(qiáng)功效。最 佳輔助脂質(zhì)的選擇取決于可電離脂質(zhì)材料和RNA載體。例如，對于類脂質(zhì)材料，飽和輔助脂質(zhì)（如DSPC）最適合傳遞短RNA（如siRNA），而不飽和脂質(zhì)（如DOPE）最適合傳遞mRNA 。DSPC已被用于FDA批準(zhǔn)的SARS-CoV-2疫苗mRNA-1273和BNT162b2中。

       LNPs的聚乙二醇化脂質(zhì)成分由聚乙二醇（PEG）與錨定脂質(zhì)（如DMPE或DMG）結(jié)合而成。親水性PEG可以穩(wěn)定LNP，通過限制脂質(zhì)融合調(diào)節(jié)納米顆粒大小，并通過減少與巨噬細(xì)胞的非特異性相互作用增加納米顆粒半衰期。mRNA-1273和BNT162b2 SARS-CoV-2疫苗均含有聚乙二醇化脂質(zhì)。

       2.聚合物和聚合物納米顆粒

       盡管臨床進(jìn)展不如LNP，但聚合物具有與脂質(zhì)相似的優(yōu)勢，能夠有效傳遞mRNA。陽離子聚合物將核酸濃縮成具有不同形狀和大小的復(fù)合物，可通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。

       聚乙烯亞胺是研究最廣泛的核酸傳遞聚合物。盡管其功效卓越，但由于其高電荷密度，其毒性限制了應(yīng)用。此外，已經(jīng)開發(fā)出幾種毒性較小的可生物降解聚合物。例如，聚（β-氨基酯）在mRNA傳遞方面表現(xiàn)出色，尤其是對肺。

       最近開發(fā)出了一種新型的含脂聚合物，稱為電荷改變可釋放轉(zhuǎn)運(yùn)體（CARTs），它能有效地靶向T細(xì)胞，操縱T細(xì)胞是非常困難的，因此，CART 是一種極具吸引力的傳遞材料，在mRNA疫苗和基因治療領(lǐng)域具有巨大潛力。

       3.其他遞送系統(tǒng)

       除了脂質(zhì)和聚合物載體外，肽也可以將mRNA傳遞到細(xì)胞中，這要?dú)w功于其主鏈和側(cè)鏈中的陽離子或兩親胺基（例如精氨酸），這些陽離子或兩親胺基與mRNA靜電結(jié)合并形成納米復(fù)合物。例如，含有重復(fù)的精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸（RALA）基序的膜融合細(xì)胞穿透肽。

       富含精氨酸的魚精蛋白肽在中性pH下帶正電荷，也可以濃縮mRNA并促進(jìn)其傳遞。魚精蛋白與mRNA復(fù)合物激活識(shí)別單鏈mRNA的Toll樣受體（TLR7，TLR8）通路，因此，它還可以作為疫苗或免疫治療應(yīng)用的佐劑。CureVac AG正在評估一種含有魚精蛋白的遞送平臺(tái)RNActive，用于黑色素瘤、前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌的臨床試驗(yàn)。

       最后，基于角鯊烯陽離子納米乳液也可以傳遞mRNA，這些納米乳劑由油性角鯊烯核組成。一些角鯊烯制劑，如諾華的MF59，在FDA批準(zhǔn)的流感疫苗中用作佐劑。MF59使注射部位的細(xì)胞分泌趨化因子，從而招募抗原呈遞細(xì)胞，誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞，并增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞對抗原的攝取。角鯊烯基陽離子納米乳劑從內(nèi)涵體逃逸并將mRNA輸送到細(xì)胞質(zhì)中的機(jī)制尚不清楚。

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       mRNA疫苗技術(shù)創(chuàng)新

       mRNA疫苗技術(shù)最重要的創(chuàng)新在于：mRNA 序列設(shè)計(jì)；開發(fā)簡單、快速和大規(guī)模生產(chǎn) mRNA 的方法；開發(fā)高效、安全的 mRNA 疫苗遞送材料。

       最近的一項(xiàng)研究使用了一種基于細(xì)胞培養(yǎng)的系統(tǒng)選擇過程來識(shí)別新的UTRs，它顯著增加了IVT mRNA的蛋白質(zhì)表達(dá)。與人類β-珠蛋白3’UTR的相比，這些序列可以誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生大約3倍的蛋白質(zhì)。

       此外，最近報(bào)道了一種有趣的新疫苗形式，該方法利用編碼α病毒RNA依賴性RNA聚合酶的mRNA加上編碼抗原的第二個(gè)mRNA，使其在細(xì)胞質(zhì)中能夠復(fù)制。這種系統(tǒng)可以在非常低的劑量（50ng）就有效地誘導(dǎo)小鼠的保護(hù)性免疫反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)特別有吸引力，因?yàn)榈蛣┝康氖褂媒档土艘呙缟a(chǎn)的成本。無遞送材料進(jìn)一步降低了成本，簡化了制造，并且提高了疫苗凍干和在環(huán)境溫度下儲(chǔ)存的可能性。

       在生產(chǎn)方面，除了cleancap技術(shù)外，最近開發(fā)了一種通過將雙鏈RNA污染物吸附到纖維素（一種廉價(jià)且豐富的多糖）來純化mRNA的簡單方法。研究證明，這種高度可擴(kuò)展且廉價(jià)的方法與高效液相色譜法一樣有效地去除IVT mRNA樣本中的dsRNA污染物。

       在遞送材料方面，與基于聚合物的CART平臺(tái)類似，mRNA-LNPs也實(shí)現(xiàn)了選擇性T細(xì)胞靶向。一種新的平臺(tái)，稱為ASSET（錨定二級靶向單鏈抗體），其中T細(xì)胞特異性單克隆抗體與LNP相連，以靶向T細(xì)胞。這種靈活的平臺(tái)在mRNA疫苗和其他應(yīng)用方面也有很大的潛力。

       另外一種脂質(zhì)復(fù)合物在全身給藥后優(yōu)先靶向樹突狀細(xì)胞。用mRNA疫苗選擇性靶向DC以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)是一個(gè)潛在的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)，該平臺(tái)已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中證明了其前景。

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       mRNA疫苗在感染性疾病的研究進(jìn)展

       以mRNA為基礎(chǔ)的治療代表了一個(gè)相對新穎和高效的藥物類別。最近發(fā)表的幾項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了mRNA疫苗在治療不同類型的惡性腫瘤和傳染病方面的潛在療效，這些疾病中傳統(tǒng)的疫苗策略不能引起保護(hù)性免疫反應(yīng)。

       截至2019年底，15種針對傳染病的候選mRNA疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，當(dāng)時(shí)，人們認(rèn)為mRNA疫苗至少還需要5-6年才能獲得監(jiān)管部門的批準(zhǔn)。但是，當(dāng)2020年初COVID-19大流行橫行世界時(shí)，這些期望就被顛覆了。在接下來的幾個(gè)月里，mRNA疫苗的研發(fā)、制造和部署都進(jìn)入了飛速跨越的階段。

       1.SARS-CoV-2疫苗

       大多數(shù)SARS-CoV-2候選疫苗對病毒表面的棘突蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)。棘突蛋白與其宿主細(xì)胞表面的受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2結(jié)合。然后，細(xì)胞的跨膜絲氨酸蛋白酶2將附著的棘突蛋白切開，該蛋白酶誘導(dǎo)構(gòu)象變化，暴露棘突蛋白的融合肽并促進(jìn)與細(xì)胞或內(nèi)體膜的融合。通常，疫苗mRNA編碼的抗原要么是全長棘突蛋白，要么是棘突蛋白的受體結(jié)合域。

       截至2021年6月18日，185個(gè)CVID-19疫苗候選處于臨床前開發(fā)階段，另外102個(gè)已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。在臨床試驗(yàn)中，19種為mRNA疫苗。2020年12月11日，輝瑞的BNT162b2疫苗獲得了FDA的緊急授權(quán)，成為第一個(gè)獲準(zhǔn)用于人體的mRNA藥物。一周后，Moderna疫苗mRNA-1273也被授權(quán)在美國使用。最終，它們是第一批在美國、英國、加拿大和其他幾個(gè)國家獲得授權(quán)的SARS-CoV-2疫苗。

       輝瑞和BioNTech共同開發(fā)了五種mRNA候選疫苗，它們編碼棘突蛋白抗原的變體。兩個(gè)主要候選藥物BNT162b1和BNT162b2使用Acuitas Therapeutics的可電離脂質(zhì)ALC-0315和核苷修飾的mRNA，其中所有尿苷被N1甲基假尿苷取代，以增強(qiáng)mRNA翻譯。BNT162b1編碼三聚體分泌型棘突蛋白的受體結(jié)合域，而BNT162b2編碼全長SARS-CoV-2棘突糖蛋白，S2亞基中有兩個(gè)脯氨酸替換，將蛋白鎖定在融合前構(gòu)象。

       在兩種疫苗的第一階段試驗(yàn)中，都可誘導(dǎo)高滴度的中和抗體，并產(chǎn)生強(qiáng)烈的CD4+和CD8+反應(yīng)，伴有輕度至中度不良反應(yīng)。兩種候選疫苗耐受性良好且有效，但只有BNT162b2疫苗因其較輕的全身和局部不良反應(yīng)而進(jìn)入II/III期試驗(yàn)。在第三階段試驗(yàn)中，BNT162B2顯示了95%的整體預(yù)防和90～100%的療效。

       Moderna與國立衛(wèi)生研究院合作開發(fā)了mRNA-1273。該疫苗使用了可電離脂質(zhì)SM-102制備LNP，該LNP封裝N1甲基假尿苷修飾的mRNA。該序列編碼SARS-CoV-2棘突蛋白，帶有兩個(gè)脯氨酸替換，賦予融合前構(gòu)象。

       在1期臨床試驗(yàn)中， mRNA-1273非常有效且耐受性良好。在涉及30420名志愿者的III期試驗(yàn)中，兩支100μg劑量疫苗的預(yù)防率為94.1%，注射部位的局部疼痛是最常見的副作用。第二次給藥后，一半的志愿者報(bào)告了中度至重度系統(tǒng)性副作用（例如疲勞、肌肉疼痛、關(guān)節(jié)疼痛），這些副作用在48小時(shí)內(nèi)消失。

       盡管輝瑞和Moderna公司生產(chǎn)的疫苗已證明具有良好的療效和安全性，但它們對冷鏈儲(chǔ)存的需求帶來了保障的巨大困難。mRNA-1273可在4-8℃下儲(chǔ)存持續(xù)一個(gè)月，而BNT162b2則需要在-60℃條件下儲(chǔ)存。

       CureVac的候選疫苗CVnCoV在5℃下可穩(wěn)定儲(chǔ)存3個(gè)月。CVnCoV使用Acuitas Therapeutics（可能是ALC-0315）的可電離脂質(zhì)和編碼具有兩個(gè)脯氨酸替代物的全長棘突蛋白的未修飾mRNA。在第一階段臨床試驗(yàn)中，志愿者產(chǎn)生的中和抗體與CVID-19恢復(fù)期患者相似，耐受性良好。然而不幸的是，在包括4萬人的III期臨床試驗(yàn)中，CVnCoV僅顯示出47%的療效。中期分析表明，CVnCoV的較低療效歸因于新出現(xiàn)的SARS-CoV-2變異。

       目前，CureVac正與GSK合作，開發(fā)第二代候選藥物——CV2CoV，該藥物經(jīng)過優(yōu)化，以增強(qiáng)相對于CVnCoV的翻譯和免疫原性。CV2CoV使用來自人類羥基類固醇17-β-脫氫酶4基因的5′UTR和來自人類蛋白酶體20S亞單位β3基因的3′UTR。在臨床前研究中，CV2CoV在體外顯示出比CVnCoV高1.8倍的蛋白表達(dá)，并在大鼠中誘導(dǎo)針對B.1.1.7、B.1.1.298和B.1.351變體的高滴度交叉中和抗體。

       另一種耐熱候選疫苗ARCoV由中國人民解放軍軍事科學(xué)院與Walvax生物技術(shù)公司合作開發(fā)，可以在25℃穩(wěn)定一周。ARCoV編碼棘突蛋白的受體結(jié)合域。在臨床前研究中，在食蟹猴中可誘導(dǎo)高SARS-CoV-2特異性IgG抗體和強(qiáng)病毒中和滴度。盡管CVnCoV和ARCoV熱穩(wěn)定性背后的原因尚不清楚，但mRNA二級結(jié)構(gòu)、較小的mRNA大小、GC含量和脂質(zhì)可能是重要因素。

       其它一些mRNA候選疫苗也正在研制中。LNP-nCoVsaRNA由倫敦帝國理工學(xué)院和Acuitas Therapeutics合作開發(fā)，編碼全長棘突蛋白。目前，正在使用0.1–1μg劑量遞增方案進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)評估（ISRCTN17072692），其使用了所有候選mRNA疫苗中最低的RNA劑量。

       另一種自擴(kuò)增mRNA疫苗候選物ARCT-021（也稱為LUNAR-COV19）由Arcturus公司利用其專有的LUNAR脂質(zhì)載體和自轉(zhuǎn)錄和復(fù)制RNA（STARR）平臺(tái)開發(fā)。它編碼全長融合前棘突蛋白。

       2.流感病毒疫苗

       全世界每年約有29萬至65萬人死于流感病毒。目前的疫苗以促進(jìn)病毒進(jìn)入的病毒血凝素蛋白為靶標(biāo)。傳統(tǒng)的流感疫苗是生長在雞蛋中的滅活流感病毒，生產(chǎn)時(shí)間長，純化困難。此外，病毒會(huì)在雞蛋中發(fā)生變異以獲得最 佳生長，有時(shí)會(huì)使它們在人類中無效。

       因此，確實(shí)需要替代的抗原靶點(diǎn)和生產(chǎn)方法。體外轉(zhuǎn)錄的合成mRNAs可以滿足這一需求，并確保在出現(xiàn)全新流感毒株時(shí)快速生產(chǎn)疫苗。例如，2013年，基于LNP（DLinDMA）的自我擴(kuò)增mRNA疫苗在中國H7N9爆發(fā)后8天內(nèi)迅速研制成功，然而不幸的是，由于當(dāng)時(shí)沒有用于mRNA制造的GMP設(shè)施，未能進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

       也有人致力于研制一種不需要每年修改的通用流感疫苗。這種疫苗可以對幾種流感病毒株和亞型產(chǎn)生免疫力。在2012年首次展示的流感mRNA疫苗，三次皮內(nèi)注射在小鼠中分別誘導(dǎo)針對H1N1和H5N1毒株的同源和異源免疫。

       值得注意的是，不易發(fā)生突變的血凝素保守柄區(qū)最近已成為一種新型通用疫苗靶標(biāo)。還有另一項(xiàng)研究使用LNPs來遞送50ng劑量的mRNA，編碼三種保守的流感蛋白：神經(jīng)氨酸酶、核蛋白和基質(zhì)-2離子通道蛋白以及血凝素柄區(qū)。令人難以置信的是，這種微小的mRNA劑量產(chǎn)生了廣泛的保護(hù)性抗體。

       3.寨卡病毒疫苗

       寨卡病毒感染于1947年首次被發(fā)現(xiàn)，感染寨卡病毒的患者通常無癥狀或出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹和肌肉疼痛等輕微癥狀。然而，寨卡病毒在2015-2016年美洲流行期間成為全球健康危機(jī)，該病毒在懷孕期間導(dǎo)致嚴(yán)重胎兒神經(jīng)畸形和胎兒死亡。膜和包膜蛋白（prM-E）是針對寨卡病毒的mRNA疫苗常見的抗原選擇，因?yàn)獒槍rM-E的中和抗體可以防止病毒融合。

       Moderna與華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院合作，開發(fā)了一種改良的prM-E mRNA，其中包含E蛋白中的突變?nèi)诤檄h(huán)形表位。兩個(gè)10μg劑量的mRNA可保護(hù)小鼠免受寨卡病毒攻擊，并減少登革熱增強(qiáng)抗體的產(chǎn)生。這些令人鼓舞的臨床前結(jié)果促進(jìn)了I期試驗(yàn)的進(jìn)行，中期結(jié)果表明，疫苗mRNA-1893在10天內(nèi)誘導(dǎo)94-100%的血清轉(zhuǎn)陽，耐受性良好。

       此外，另一項(xiàng)研究使用被動(dòng)免疫方法，利用基于角鯊烯的納米載體遞送編碼ZIKV中和抗體的mRNA。對于免疫系統(tǒng)受損而無法合成自身抗體的免疫缺陷患者來說，這是一種很有吸引力的方法。

       4.HIV病毒疫苗

       全球范圍內(nèi)，艾滋病毒目前影響3800萬人，預(yù)計(jì)到2030年將影響多達(dá)4200萬人。盡管已進(jìn)行了30年的研究，但尚未開發(fā)出有效的疫苗，這主要是因?yàn)镠IV包膜蛋白具有顯著的抗原性多樣性以及隱藏關(guān)鍵包膜蛋白表位“聚糖屏障”。幾項(xiàng)臨床前研究已經(jīng)使用了多種載體，包括陽離子納米乳劑、DOTAP/DOPE脂質(zhì)體、Polymers和可電離LNP，它們在不同程度看到了一些效果。這些研究表明，除了有效的載體外，新的抗原對于有效地靶向HIV是非常關(guān)鍵的。

       5.呼吸道合胞病毒疫苗

       呼吸道合胞病毒是全球急性下呼吸道感染的主要原因。每年，估計(jì)有60000名5歲以下兒童死亡，超過14000名65歲以上的人死亡。

       目前的RSV候選疫苗主要針對高度保守的F蛋白。盡管一些候選者由于中和抗體滴度不足而未能通過臨床試驗(yàn)，但對F蛋白構(gòu)象的新發(fā)現(xiàn)表明，針對融合前構(gòu)象接種疫苗可產(chǎn)生優(yōu)異的中和抗體反應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)有望改進(jìn)未來的疫苗設(shè)計(jì)。

       Moderna正在評估編碼融合前F蛋白的三種單劑量候選疫苗：mRNA-1172和mRNA-1777用于成人，以及mRNA-1345用于兒童。在I期臨床試驗(yàn)中，mRNA-1777誘導(dǎo)RSV中和抗體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液反應(yīng)，CD4+T細(xì)胞對RSV F蛋白產(chǎn)生反應(yīng)，且無嚴(yán)重不良事件。mRNA-1345的序列已被進(jìn)一步設(shè)計(jì)和密碼子優(yōu)化，以增強(qiáng)相對于mRNA-1777的翻譯和免疫原性。接種后1個(gè)月，mRNA-1345產(chǎn)生的中和抗體滴度約為mRNA-1777的八倍。最終，Moderna的目標(biāo)是將mRNA-1345與其兒科人類偏肺病毒/副流感病毒3型（hMPV/PIV3）候選疫苗mRNA-1653整合，并用單一配方為兒童接種針對三種不同病原體的疫苗。

       6.埃博拉病毒疫苗

       埃博拉病毒（EBOV）于1976年首次被確定為導(dǎo)致埃博拉病爆發(fā)的病原體。這種病毒性出血熱在2014-2016年西非埃博拉疫情中奪走了11000多條生命。2019年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了一種基于重組水泡性口炎病毒（VSV）的埃博拉疫苗（rVSV-EBOV）。盡管與未接種疫苗相比，rVSV-EBOV在預(yù)防埃博拉傳播方面的有效性為97.5%，但臨床試驗(yàn)注意到一些安全問題（例如急性關(guān)節(jié)炎和皮疹）。

       抗EBOV的mRNA疫苗可能比這種基于病毒的疫苗更安全，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)在體內(nèi)復(fù)制。一種編碼EBOV糖蛋白的mRNA疫苗已在小鼠中證明了效力。該疫苗通過CD8+和CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)糖蛋白特異性IgG抗體和IFN-γ以及IL-2的強(qiáng)烈表達(dá)，可保護(hù)動(dòng)物免受致命病毒的傷害。

       7.狂犬病毒疫苗

       狂犬病是一種人畜共患病，以神經(jīng)癥狀為特征，死亡率近100%。盡管已有疫苗獲批，但每年仍有5萬多人死于狂犬病，這突出表明需要更有效、更廉價(jià)的疫苗。

       為了滿足這一需求，CureVac利用其RNActive平臺(tái)，篩選出編碼狂犬病病毒糖蛋白的未經(jīng)修飾的mRNA疫苗CV7201。在一項(xiàng)臨床前研究中，CV7201可誘導(dǎo)小鼠和豬的高中和抗體滴度，并誘發(fā)抗原特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。但是在I期臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雖然給藥途徑不影響免疫反應(yīng)，但給藥裝置只有皮內(nèi)注射器產(chǎn)生短暫的體液免疫反應(yīng)。這種弱的給藥效果以及高發(fā)生率的不良事件表明需要進(jìn)一步優(yōu)化給藥平臺(tái)。

       隨后，CureVac使用Acuitas Therapeutics生產(chǎn)的專有LNP作為其新疫苗CV7202的載體。在一項(xiàng)臨床前研究中，CV7202誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)抗體滴度和CD8+和CD4+T細(xì)胞反應(yīng)。I期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，兩個(gè)1μg劑量可產(chǎn)生高滴度中和抗體以及強(qiáng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，耐受性良好。

       8.瘧原蟲疫苗

       盡管開發(fā)中的絕大多數(shù)mRNA疫苗是為了防止病毒感染，但也有預(yù)防其他傳染病的努力。瘧疾是由單細(xì)胞真核寄生蟲引起的，其發(fā)病率和殺傷力位居榜首。每年，瘧疾折磨著全世界2億多人，奪走40多萬患者的生命。由于缺乏表面抗原和瘧原蟲的復(fù)雜生命周期，抗瘧疫苗的生產(chǎn)一直很困難。幸運(yùn)的是，人體對瘧原蟲感染的自然免疫反應(yīng)的研究已經(jīng)確定了潛在的非表面抗原靶點(diǎn)。

       例如，瘧原蟲分泌的細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（PMIF）已被證明可阻止T細(xì)胞產(chǎn)生長期記憶。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，從基于角鯊烯的陽離子納米乳劑中制備了一種疫苗，該納米乳劑裝載有編碼PMIF的自擴(kuò)增mRNA。兩個(gè)15μg劑量可改善輔助性T細(xì)胞的發(fā)育，并誘發(fā)抗瘧原蟲IgG抗體和記憶性T細(xì)胞反應(yīng)。

       另一項(xiàng)關(guān)于瘧疾感染的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，惡性瘧原蟲富含谷氨酸蛋白（PfGARP）是一種潛在的mRNA疫苗靶點(diǎn)。一種編碼PfGARP抗原的核苷修飾mRNA疫苗正在開發(fā)中，該疫苗使用了Acuitas Therapeutics專有的LNP。臨床前研究表明，該疫苗可以降低動(dòng)物感染瘧原蟲后的反應(yīng)。

       5

       mRNA疫苗的關(guān)鍵問題

       目前，針對mRNA疫苗的安全性人們還有很多疑惑。此外，mRNA疫苗也只有在SARS-CoV-2的預(yù)防中獲得批準(zhǔn)，在其它方面的療效還有待進(jìn)一步研究。很多問題需要解決，下面我們來一起探討未來mRNA疫苗可能會(huì)面臨的一些關(guān)鍵問題。

       1.抗原反應(yīng)持續(xù)時(shí)間

       接種疫苗后，抗原被抗原呈遞細(xì)胞吸收并運(yùn)輸?shù)搅馨徒Y(jié)，在淋巴結(jié)中，B細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞和濾泡輔助性T細(xì)胞（Tfh）之間的相互作用促進(jìn)生發(fā)中心的形成。在生發(fā)中心內(nèi)，B細(xì)胞隨后增殖、分化并突變其抗體基因，以產(chǎn)生針對攻擊性抗原的高親和力中和抗體。生發(fā)中心反應(yīng)和Tfh細(xì)胞誘導(dǎo)對于持久的抗體反應(yīng)至關(guān)重要，這將保護(hù)患者數(shù)月或數(shù)年。

       為了增強(qiáng)這一免疫反應(yīng)過程的第一步，一些傳遞系統(tǒng)以抗原呈遞細(xì)胞為靶點(diǎn)，翻譯mRNA。積極靶向抗原呈遞細(xì)胞的幾種有希望的策略包括將單克隆抗體與LNP表面結(jié)合，并用樹突狀細(xì)胞特異性配體修飾LNP表面?；蛘?，調(diào)節(jié)LNP的物理性質(zhì)，如表面電荷，已用于提高癌癥疫苗療效。

       此外，通過延長抗原mRNA的翻譯來改變疫苗藥代動(dòng)力學(xué)已成為增強(qiáng)抗體反應(yīng)的令人興奮的工具。生發(fā)中心反應(yīng)期間持續(xù)的抗原可用性已被證明可使抗體產(chǎn)生量增加約10倍。在小鼠中的一項(xiàng)研究表明，與未經(jīng)修飾的mRNA相比，核苷修飾的mRNA循環(huán)時(shí)間更長，并誘導(dǎo)更強(qiáng)的Tfh細(xì)胞和生發(fā)中心B細(xì)胞反應(yīng)。

       在臨床試驗(yàn)中，兩次劑量的mRNA-1273也能在6個(gè)月內(nèi)引發(fā)持久的抗體反應(yīng)。盡管抗體滴度在研究期間略有下降，但所有年齡組均保持較高的中和能力。這些結(jié)果是有希望的，然而，抗體反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間是一個(gè)復(fù)雜的現(xiàn)象，不同的抗原會(huì)有所不同，需要更長期的數(shù)據(jù)才能全面理解。

       2.針對病毒的突變

       病毒基因組的突變在復(fù)制過程中很常見。盡管大多數(shù)突變對病毒的功能影響很小或沒有影響，但一些突變可以增強(qiáng)免疫逃避，阻礙疫苗的開發(fā)。例如，30多年來，艾滋病毒的快速突變阻礙了有效疫苗的開發(fā)，而流感病毒的突變需要每年對疫苗配方進(jìn)行修改，以針對優(yōu)勢毒株。

       新出現(xiàn)的SARS-CoV-2變異也引起了對mRNA疫苗交叉變異效力的關(guān)注。B.1.351和P.1變體在棘突蛋白受體結(jié)合域的484位（E484K）存在谷氨酸（E）到賴氨酸（K）突變，這促進(jìn)了免疫逃避。幸運(yùn)的是，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273產(chǎn)生了針對B.1.351和P.1以及其他變體的交叉中和抗體，這表明它們可以提供針對它們的保護(hù)。然而，與最 先的病毒相比，交叉中和效應(yīng)已經(jīng)顯著降低。此外，在CureVac的候選CVnCoV的IIb/III期試驗(yàn)中，測序的124個(gè)COVID-19病例中有57%都是突變體，包括B.1.351和P.1變體。

       如果這些變異毒株隨時(shí)間逐漸成為主要變異體，則可能需要變異體特異mRNA增強(qiáng)劑。目前，Moderna正在評估最初的mRNA-1273疫苗和作為第三劑增強(qiáng)劑的最新版疫苗：mRNA-1273.351，它編碼來自B.1.351變體的棘突蛋白，以及mRNA-1273.211，一種mRNA-1273和mRNA-1273.351的1:1的混合疫苗。

       從長遠(yuǎn)來看，提供SARS-CoV-2和未來冠狀病毒爆發(fā)保護(hù)的泛冠狀病毒疫苗將會(huì)更有利。與HIV和流感一樣，新的結(jié)構(gòu)洞察有望促進(jìn)冠狀病毒保守位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，加速抗原發(fā)現(xiàn)和疫苗設(shè)計(jì)。

       3.安全性

       總的來說，mRNA疫苗具有良好的安全性，臨床試驗(yàn)中僅發(fā)生輕度或中度不良事件。然而，也有個(gè)別事件要求進(jìn)一步優(yōu)化mRNA抗原和運(yùn)載工具組件。例如，CureVac基于魚精蛋白的狂犬病候選藥物CV7201在78%的參與者中引發(fā)嚴(yán)重不良事件，促使CureVac采用LNPs作為其后續(xù)狂犬病候選藥物CV7202的首選給藥平臺(tái)。

       與大多數(shù)藥物一樣，mRNA疫苗的不良反應(yīng)往往隨著劑量的增加而增加。例如，在CV7202的第一階段試驗(yàn)中，5μg劑量具有不可接受的毒性，而1μg是耐受性良好的最高劑量。此外，在Moderna H10N8流感疫苗的第一階段試驗(yàn)中，在400ug劑量患者出現(xiàn)嚴(yán)重不良事件，因此，試驗(yàn)以100μg劑量繼續(xù)。

       在使用Pfizer–BioNTech和Moderna的COVID-19疫苗時(shí)，分別在約百萬分之4.7和百萬分之2.5的接種者中觀察到過敏反應(yīng)，這大約是傳統(tǒng)疫苗接種的2-4倍。一種說法認(rèn)為，過敏反應(yīng)歸因于人群中預(yù)先存在的針對LNP中聚乙二醇化脂質(zhì)的抗體。這些抗體被認(rèn)為對許多消費(fèi)品（例如牙膏、洗發(fā)水和瀉藥）中的PEG存在反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，40%的人群中存在抗PEG抗體，這可能會(huì)增加某些個(gè)體發(fā)生過敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，并阻礙疫苗的效力。目前，CDC建議，對于對Pfizer–BioNTech或Moderna疫苗的任何成分有過敏史的個(gè)人，不應(yīng)使用mRNA疫苗。很明顯，我們需要更好地理解mRNA疫苗配方是如何引起過敏反應(yīng)的，以便可以重新設(shè)計(jì)配方以改善安全性。

       4.特定人群的疫苗接種

       大多數(shù)疫苗，無論是傳統(tǒng)疫苗還是mRNA疫苗，都是針對兒童或健康成人開發(fā)的。然而，由于免疫系統(tǒng)的不同，一些人群可能受益于替代疫苗接種策略或?qū)σ呙缃臃N的反應(yīng)不同。

       ●　產(chǎn)婦/新生兒疫苗接種

       懷孕期間免疫系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)特性增加了一個(gè)人對傳染病的易感性，而感染會(huì)對產(chǎn)婦健康和胎兒發(fā)育造成災(zāi)難性影響。

       為了應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，產(chǎn)婦疫苗接種已成為改善產(chǎn)婦健康和降低新生兒發(fā)病率的工具。母體IgG抗體通過與新生兒Fc受體結(jié)合，很容易穿過胎盤，進(jìn)入胎兒循環(huán)，保護(hù)胎兒免受病原體的侵害。在幾項(xiàng)研究中，母親接種mRNA負(fù)載的LNPs可防止懷孕小鼠中的胎兒寨卡病毒傳播，并保護(hù)新生小鼠免受皰疹病毒和鏈球菌的感染。

       盡管垂直轉(zhuǎn)移的母體抗體可以防止新生兒感染，但它們也會(huì)阻礙對嬰兒在以后的生活中接種疫苗的效果，其機(jī)制尚不清楚。延長抗原的可用性可能促進(jìn)更強(qiáng)烈的生發(fā)中心反應(yīng)，從而在存在母體抗體的情況下產(chǎn)生強(qiáng)大的嬰兒免疫反應(yīng)。

       抗SARS-CoV-2的mRNA疫苗也被證明對懷孕和哺乳期人群具有免疫原性，并且在臍血和人類乳汁中檢測到中和抗體。初步數(shù)據(jù)表明，mRNA-1273和BNT162b2在懷孕和非懷孕人群中引發(fā)類似的不良事件，并且疫苗不會(huì)增加新生兒死亡或先天性異常的發(fā)生率。然而，需要進(jìn)一步的縱向研究來評估m(xù)RNA疫苗對產(chǎn)婦和新生兒健康的影響。

       ●　老年人

       這一群體急需有效的疫苗，因?yàn)樵S多傳染病影響著老年人。例如，70至90%的流感相關(guān)死亡率發(fā)生在65歲以上的患者中，而COVID-19的死亡率在大于65歲的患者中是年輕患者的62倍。

       老年人更難接種疫苗，因?yàn)槔淆g化對免疫系統(tǒng)的先天和適應(yīng)性反應(yīng)都有不利影響。Toll樣受體表達(dá)減少會(huì)阻止單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和趨化因子，并限制與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的串?dāng)_。由于細(xì)胞因子信號(hào)受損以及生理和細(xì)胞變化，感染期間的適應(yīng)性免疫反應(yīng)通常不充分。這些變化包括胸腺退化、幼稚B細(xì)胞和T細(xì)胞減少、T細(xì)胞受體多樣性減少、對T細(xì)胞凋亡的更高易感性以及細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞上關(guān)鍵受體如CD28的表達(dá)減少。

       幸運(yùn)的是，越來越多的證據(jù)表明，mRNA疫苗可能在所有年齡組都具有強(qiáng)大的效力。例如，在III期試驗(yàn)中，Pfizer–BioNTech的候選疫苗BNT162b2在所有治療組中的療效均超過93%。Moderna候選疫苗mRNA-1273也非常有效，在≥65歲的志愿者中顯示出86.4%的有效性，相比之下，18-65歲志愿者的療效為95.6%。

       運(yùn)載工具的設(shè)計(jì)對于提高老年人的疫苗效力非常重要。mRNA載體可以作為炎癥佐劑，通過增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞向注射部位的募集來放大疫苗反應(yīng)。在一項(xiàng)臨床前研究中，CureVac的RNAVAC激活了TLR7，并在小鼠中產(chǎn)生了針對致命流感的持久免疫應(yīng)答。諾華公司的乳劑MF59已經(jīng)被用作mRNA遞送載體，也可以作為佐劑。MF59增強(qiáng)了流感疫苗的免疫原性，已被批準(zhǔn)用于老年人。

       5.疫苗的獲得

       獲得疫苗是實(shí)現(xiàn)廣泛預(yù)防傳染病的最大挑戰(zhàn)，特別是在低收入國家。目前批準(zhǔn)的SARS-CoV-2 mRNA疫苗的冷藏要求進(jìn)一步限制了疫苗的獲取。便攜式和可重復(fù)使用的Arktek冷凍柜可以在流行病期間實(shí)現(xiàn)數(shù)百萬劑疫苗的快速部署。

       然而，在COVID-19病毒需要接種數(shù)十億人，這需要耐熱疫苗。目前，有兩種SARS-CoV-2候選疫苗在室溫下具有耐熱性，如果這些耐熱候選疫苗在臨床試驗(yàn)中能夠顯示出良好的結(jié)果，他們可能在不久的將來簡化全球?qū)RNA疫苗的獲取。

       6.疫苗的接受度

       疫苗只有在接種后才有效，支持疫苗安全性和有效性的數(shù)據(jù)非常豐富，疫苗已經(jīng)在世界部分地區(qū)根除了幾種傳染病，挽救了無數(shù)人的生命。然而，由于錯(cuò)誤信息和反疫苗運(yùn)動(dòng)，公眾的不信任感加劇，威脅到群體免疫力的維持，并使我們最脆弱的人群處于危險(xiǎn)之中。

       疫苗接種覆蓋率下降可能導(dǎo)致威脅生命的疾病再次出現(xiàn)。例如，2000年從美國根除的麻疹在2019年感染了1200多人，原因是多個(gè)社區(qū)的疫苗依從性差。對于COVID-19，在美國，目前56–75%的接受度可能不足以達(dá)到至少80–90%的覆蓋率，這一閾值被認(rèn)為是對SARS-CoV-2群體免疫所必需的。

       盡管提高疫苗覆蓋率的大部分負(fù)擔(dān)落在政府和公共衛(wèi)生官員身上，科學(xué)界也可以通過提高mRNA疫苗的效力和安全性來提供幫助。提高療效將降低群體免疫所需的接受度，提高安全性將阻止媒體對不良事件的報(bào)道，從而減少對疫苗接種的恐懼。

       — 小結(jié) —

       幾十年來，mRNA設(shè)計(jì)和核酸遞送技術(shù)的進(jìn)步，加上新抗原靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，使得mRNA疫苗成為對抗新興流行病和現(xiàn)有傳染病的非凡工具。兩種針對SARS-CoV-2的mRNA疫苗，以革命性的速度研制，并提供了卓越的保護(hù)率，有望結(jié)束COVID-19的大流行。

       此外，這些疫苗將LNP和RNA治療從小眾市場的產(chǎn)品提升為在大量人群中成功實(shí)施的預(yù)防性治療。由此產(chǎn)生大量的安全性和有效性數(shù)據(jù)，以及成功的監(jiān)管部門批準(zhǔn)。我們可以樂觀地認(rèn)為，mRNA療法將可能改變現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的疫苗接種方法、癌癥免疫療法以及蛋白質(zhì)替代療法。