從胰島素到GLP-1藥物——多肽合成歷史變遷

       去年兩項大型臨床試驗顯示，GLP-1受體激動劑不僅能夠有效降低體重，還能夠改善肥胖相關(guān)的心血管和腎臟疾病，被《科學(xué)》雜志評為年度突破。

       GLP-1類似物是多肽藥物的一個重要類別，GLP-1藥物的成功推動了多肽藥物市場持續(xù)擴容，多肽制藥工藝研究成為當(dāng)前多肽研究的前沿與熱點。

       多肽藥物簡史

       合成技術(shù)的進步推動多肽藥物開發(fā)

       多肽藥物是一種介于小分子化學(xué)藥物和大分子蛋白質(zhì)藥物之間的“獨特藥物”，由氨基酸組成。它們因具有較少的副作用、高度的特異性和優(yōu)異的療效而被廣泛關(guān)注。此外，多肽藥物的結(jié)構(gòu)明確且質(zhì)量可控，使其在藥物開發(fā)過程中更為可靠。

       小分子、多肽藥物、生物制劑優(yōu)缺點比較

       圖片來源：參考資料1

       1922年，第一種多肽藥物胰島素被引入市場，最初是從牛和豬的胰腺中提取的，用于治療糖尿病。

       1954年，化學(xué)家文森特·迪維尼奧首次完成了催產(chǎn)素和血管加壓素的全合成，并因此獲得1955年諾貝爾化學(xué)獎。

       1963年，固相多肽合成（SPPS）技術(shù)誕生，通過在固相上組裝氨基酸，實現(xiàn)了多肽合成的自動化，極大地促進了多肽藥物的開發(fā)。

       20世紀(jì)80年代多肽重組技術(shù)的出現(xiàn)，使大規(guī)模生產(chǎn)綠色多肽成為可能。

       得益于在制備技術(shù)、劑型與給藥途徑、緩釋技術(shù)等方面的重大突破，多肽藥物在醫(yī)藥領(lǐng)域的潛力正在逐漸得到實現(xiàn)。目前全球已有超過100種多肽藥物上市，200種多肽藥物正在臨床試驗階段，廣泛用于免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、心血管疾病等多個治療領(lǐng)域。

       多肽藥物GLP-1類藥物（用于治療肥胖癥和糖尿病）和生長 激素是多肽藥物市場中的典型代表，展示了這一領(lǐng)域的巨大潛力和發(fā)展前景。

       GLP-1爆火

       多肽需求增長，工藝研究成熱點

       目前，多肽重磅藥品主要集中于糖尿病領(lǐng)域。2022年司美格魯肽、度拉糖肽、門冬胰島素、賴脯胰島素、甘精胰島素銷售額超過20億美元。

       除減肥、糖尿病之外，其他疾病領(lǐng)域也有不少多肽暢銷藥，涉及多家大型制藥企業(yè)和生物技術(shù)公司。

       腫瘤領(lǐng)域，Ipsen(益普生)的蘭瑞肽、諾華的奧曲肽2022年銷售額都超過了10億美元。此外，諾華的放射 性多肽靶向腫瘤治療藥物Pluvicto自2022年3月獲得FDA批準(zhǔn)以來快速放量，2023年銷售額有望突破10億美元，躋身重磅炸 彈行列。

       抗感染領(lǐng)域，輝瑞的Paxlovid曾在新冠病毒防治中發(fā)揮了重要作用，2022年銷售額更是達到了189美元，成為當(dāng)年最暢銷的小分子藥品。

       罕見病也是多肽藥物的主戰(zhàn)場。梯瓦（Teva）研發(fā)并于1996年上市的格拉替雷曾是多肽藥物中最大的品種，2014年其全球銷售額達42.37億美元，用于治療多發(fā)性硬化癥(MS)。2023年6月28日，醋酸格拉替雷注射液（商品名：固派松）獲得在中國正式批準(zhǔn)，適用于治療復(fù)發(fā)型多發(fā)性硬化（MS）成人患者。

       當(dāng)然，近兩年最受關(guān)注的莫過于GLP-1類多肽藥物。GLP-1激動劑主要通過刺激胰島釋放葡萄糖依賴性胰島素發(fā)揮作用。其次，這類藥物還能減緩胃排空和抑制食欲。美國疾病控制與預(yù)防中心（CDC）的數(shù)據(jù)顯示，約有3500萬美國人患有2型糖尿病，全球糖尿病患者約4.6億，占全球總?cè)丝诘?.3%。這一數(shù)據(jù)體現(xiàn)了抗糖尿病藥物市場的巨大規(guī)模。

       最初，天然腸促胰島素并不適合作為藥物開發(fā)的候選物，但隨著對降糖尿藥物需求的增加，研究人員最終將GLP-1受體激動劑開發(fā)成藥物。

       司美格魯肽作為目前GLP-1激動劑的代表產(chǎn)品，通過在第2位上將甘氨酸替換為2-氨基異丁酸(Aib)以及十八烷二酸與Lys-26側(cè)鏈的連接，實現(xiàn)了對自然肽的有效改造。這種改造增強了其對蛋白水解酶DPP-4的抵抗能力，并通過脂肪酸部分與血清白蛋白高度結(jié)合，將人體內(nèi)半衰期延長至約7天。

       天然GLP-1及其多肽類藥物的序列和結(jié)構(gòu)。利拉魯肽是一種源自GLP-1的肽藥物，在其天然序列的第26位（K）進行了修飾。

       圖片來源：參考論文1

       目前司美格魯肽已獲批糖尿病和肥胖兩大適應(yīng)癥，諾和諾德還在推進司美格魯肽在心血管疾病、NASH、CKD、PAD、阿爾茨海默病、心衰領(lǐng)域的臨床研究。

       由于需求激增，諾和諾德的司美格魯肽、利拉魯肽都出現(xiàn)短缺。應(yīng)對產(chǎn)能供應(yīng)不足的問題，諾和諾德擬在其位于丹麥希勒勒德的工廠增加原料藥（API）的生產(chǎn)能力，以支持諾和諾德在嚴(yán)重慢性病領(lǐng)域的未來產(chǎn)品組合。

       另一方面，行業(yè)需求的增加帶來多肽藥物CDMO的持續(xù)火熱。全球領(lǐng)先的CDMO企業(yè)正在大力發(fā)展多肽合成業(yè)務(wù)，進行多方位產(chǎn)能建設(shè)，以迅速填補多肽藥物產(chǎn)能需求。

       這也引發(fā)了全球?qū)Χ嚯乃幬锂a(chǎn)能的關(guān)注，多肽藥物工藝研究因此成為當(dāng)前多肽研究的前沿與熱點。

       合成與改良

       多肽化學(xué)合成法成主流

       發(fā)現(xiàn)具有潛在治療作用的活性分子是肽類藥物開發(fā)的第一步，其次是通過化學(xué)或生物合成以及序列修改來提高其藥理學(xué)特性。最后，多肽藥物的量產(chǎn)則需要通過工業(yè)化生產(chǎn)才能實現(xiàn)。

       傳統(tǒng)多肽藥物的研發(fā)主要采取生物發(fā)酵法，存在著生產(chǎn)成本高、純度低、穩(wěn)定性差等問題。隨著多肽合成技術(shù)的不斷進步，現(xiàn)代多肽藥物的研發(fā)主要依賴于人工合成。

       實驗室合成多肽藥物相對簡單，但在進行多肽工業(yè)化生產(chǎn)時需要考慮多方面的問題，包括技術(shù)應(yīng)用、生產(chǎn)工藝、過程控制、產(chǎn)量規(guī)模、設(shè)備需求、生產(chǎn)成本、質(zhì)量管理、環(huán)保要求等。其主要技術(shù)挑戰(zhàn)在于提純難度較大且過程控制要求高，同時還需要考慮產(chǎn)量規(guī)模、生產(chǎn)布局與設(shè)備需求，控制生產(chǎn)成本。同時多肽藥物生產(chǎn)需要遵循嚴(yán)格的質(zhì)量管理規(guī)范，符合法律法規(guī)的要求，最后要重視環(huán)保要求，提高資源利用效率，減少廢棄物產(chǎn)生。

       綜上考慮，在已有的多肽合成方法中，目前已上市的多肽藥物多數(shù)是通過化學(xué)合成法制備，并且固相合成工藝占主導(dǎo)。據(jù)肽研社統(tǒng)計，截至2021年11月，68.8%的多肽分子通過化學(xué)合成方法制備，22.8%通過生物合成法獲得。固相合成法具有粗產(chǎn)品收率和純度高，研發(fā)周期短等優(yōu)點，而且固相合成可以切成多個片段，分包給全球不同的生產(chǎn)服務(wù)商，再組裝成API，從而有效地規(guī)避風(fēng)險。

       例如采用固相合成法合成縮宮素，高效、安全、環(huán)保、質(zhì)量好、自動化程度高，相比液相合成法在規(guī)模級工業(yè)化生產(chǎn)具有一定優(yōu)勢。此外，化學(xué)合成法在類似物合成方面有著與生物合成法無法比擬的獨特優(yōu)勢。通過化學(xué)合成法合成單鏈胰島素前體，可快速篩選胰島素類似物，增加化學(xué)多樣性，改善產(chǎn)物物理、化學(xué)特性，從而獲得新的治療特性，實現(xiàn)胰島素類似物的工業(yè)制造。

       固相肽合成（SPPS）技術(shù)由梅里菲爾德（Merrifield）于1963年開發(fā)。SPPS技術(shù)在方法論和合成材料方面得到了顯著改進，對現(xiàn)代肽生產(chǎn)起著至關(guān)重要的作用。

       SPPS通過在一個簡單的反應(yīng)器中結(jié)合氨基酸偶聯(lián)和脫保護步驟，進一步促進了自動肽合成器的發(fā)明。與重組技術(shù)相比，SPPS得到的原始肽更為單一，不含其他生物化合物如酶、DNA和RNA片段、非相關(guān)蛋白和肽。此外，SPPS最終產(chǎn)品中的雜質(zhì)易于鑒定，因為它們主要來自合成過程中的不完全反應(yīng)或副反應(yīng)，使得后續(xù)純化相對簡單。

       SPPS包括一個循環(huán)，即將氨基酸的羧基與固態(tài)聚合樹脂偶聯(lián)，并從保護基團中釋放氨基（見圖4）。使用各種樹脂，如4-甲基苯乙烯基胺（HMBA）樹脂、王氏樹脂、2-氯三苯甲烷氯化物（CTC）樹脂和梅里菲爾德樹脂，來引入肽C末端的酰胺或游離羧基。現(xiàn)代肽工業(yè)通過將樹脂與不同的連接器偶聯(lián)，開發(fā)了各種功能性樹脂，使得在固相中合成長肽和肽環(huán)化成為可能。

       固態(tài)多肽合成（SPPS）原理示意圖

       圖片來源：參考資料1

       在合成過程中，氨基酸的氨基和側(cè)鏈通常通過不同的化學(xué)基團保護，這會導(dǎo)致肽聚集并降低原始肽的純度。兩種主要的SPPS策略：Fmoc-SPPS和Boc-SPPS，分別用于去除主要的氨基保護基團，即熒光甲氧基羰基（Fmoc）和叔丁氧羰基（Boc）。

       Boc-SPPS使用三氟乙酸溶液去除氨基保護基團，并使用氫氟 酸溶液切割最終的肽，但這些過程伴隨著刺激性氣味和毒性。Fmoc在較溫和的條件下可被去除，因此Fmoc-SPPS策略通常更受青睞。然而，對于長肽合成而言，Boc-SPPS有其優(yōu)勢，因為三氟乙酸脫保護有效地破壞了肽合成過程中的聚集。

       Fmoc-SPPS研究目前專注于解決兩個主要問題，包括長肽合成過程中的聚集和某些序列中天冬酰亞胺的形成。

       長肽合成過程中的聚集問題，可采取使用低取代樹脂分離肽鏈、使用微波減少反應(yīng)時間、混合溶劑作為反應(yīng)溶液以及使用偽脯氨酸打破肽鏈骨架的氫鍵等方法，以避免或減少SPPS過程中的聚集。

       天冬酰亞胺在Fmoc-SPPS過程中的形成顯著降低了原始肽的純度。減少天冬酰亞胺形成的解決方案包括使用微波減少反應(yīng)時間、使用N-α-烷基天冬酸-甘氨酸二肽或在脫保護過程中添加1-羥基苯并三唑（HOBt）、Oxyma Pure。

       固態(tài)多肽合成已成為目前多肽合成的首選，但固相合成仍存在許多缺點：

       縮合及洗滌過程中對環(huán)境不友好的溶劑(DCM和DMF等)和縮合劑的大量使用使得成本過高并引起浪費。因此當(dāng)合成大規(guī)模的短肽時,液相合成法（LPPS）相對更合適。而且隨著液相+flow技術(shù)的發(fā)展，LPPS也將是未來多肽藥物公斤或噸級規(guī)模生產(chǎn)的重要工藝路線。

       固相多肽合成的難度屬于序列依賴性，盡管合成能力上限一直在不斷提高，但長于50個氨基酸的肽（尤其是在大規(guī)模制造中）仍然難以通過固相合成一次性獲取。片段合成法是近年來發(fā)展較快的多肽合成方法，其化學(xué)專一性在長肽合成領(lǐng)域具有突出作用。片段合成法的核心思想是將目標(biāo)肽合理地分為若干片段，在合成這些片段后進行連接縮合，最終得到目標(biāo)肽。目前，應(yīng)用最廣泛的連接技術(shù)是自然化學(xué)連接（NCL）。該技術(shù)由芝加哥大學(xué)的Kent等于1994年提出，通過一個多肽片段的C-端硫酯與另一個N-端Cys多肽片段的選擇性化學(xué)反應(yīng)，在連接位點處形成天然酰胺鍵。早期， C-端硫酯的合成受到穩(wěn)定性差的困擾，近年來通過酰肼氧化的C-端硫酯原位合成及連接策略極大地促進了這一方法的應(yīng)用。多肽片段合成的其他連接方式還有天然化學(xué)連接、化學(xué)區(qū)域選擇連接、可去除輔助基連接、光敏感輔助基連接、施陶丁格連接和正交化學(xué)連接等。此外，在多肽片段合成法中，企業(yè)可以片段外包，分包生產(chǎn)。CDMO可以提供多種服務(wù)，包括多肽片段的合成、純化、結(jié)構(gòu)鑒定、質(zhì)量控制等。因此肽片段合成法已經(jīng)成為多肽藥物制備的重要手段之一。

       盡管固相合成是目前多肽工藝生產(chǎn)的主要方式，但液相合成也有不可替代的優(yōu)勢。不同于經(jīng)典的液相多肽合成，如今的液相手段增加了可溶性C-端標(biāo)簽（Tag）策略，但因其標(biāo)簽巨大的親脂性，可以通過簡單的沉淀、過濾或萃取得到這些多肽-標(biāo)簽的加合物中間體，從而實現(xiàn)類似于固相合成的洗脫法去除過量試劑和副產(chǎn)品的目的。此外，液相+flow技術(shù)的興起為化學(xué)合成多肽提供了新的方法，可以解決傳統(tǒng)單純固相SPPS合成，溶劑用量高，排放高的問題，同時液相flow技術(shù)還將進一步提高生產(chǎn)工藝效率。

       隨著對多肽研究的不斷深入，多肽合成長度和化學(xué)修飾復(fù)雜程度不斷提高，對多肽合成工藝水平提出了更高要求，單一的合成方法往往不能滿足需求，研究者常將多種方法結(jié)合使用。例如諾和諾德的司美格魯肽采取發(fā)酵+固相合成，該方法通過發(fā)酵法制備GLP-1前體分子，然后通過固相法制備最終產(chǎn)物司美格魯肽。禮來的替爾泊肽便采用固相+液相多肽合成方法，先通過固態(tài)合成某幾個片段，再通過液相合成最終的產(chǎn)物。

       多肽藥物由于技術(shù)門檻較高，主要玩家多為深耕多肽領(lǐng)域多年的專業(yè)企業(yè)。國際老牌知名多肽原料藥生產(chǎn)企業(yè)包括Bachem、Polypeptide等憑借項目經(jīng)驗、地緣優(yōu)勢、客戶關(guān)系和政策壁壘，長期占據(jù)壟斷地位。

       近年來，隨著我國企業(yè)在多肽領(lǐng)域的不斷投入和努力，多肽生產(chǎn)技術(shù)不斷發(fā)展提升。目前我國已成為多肽原料藥出口大國，同時生產(chǎn)的多肽原料藥逐漸從低端產(chǎn)品逐漸轉(zhuǎn)向氨基酸個數(shù)更多和結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜的中高端產(chǎn)品，代表企業(yè)包括諾泰生物、昂博等老牌多肽企業(yè)，以及博騰等新一代具備多肽研發(fā)生產(chǎn)能力的CDMO企業(yè)。

       小結(jié)

       多肽藥物憑借其作為天然生物分子的獨特屬性，對人類的高度特異性和低毒性，已成為創(chuàng)新藥的新重點。隨著需求的增加，多肽制藥工藝研究成為當(dāng)前多肽研究的前沿與熱點，特別是化學(xué)合成法的廣泛使用極大地提高了多肽藥物的工業(yè)化效率。但同時也應(yīng)當(dāng)注意到多肽制藥工藝存在試劑用量多等諸多問題與挑戰(zhàn)，需要多肽藥物研究者與從業(yè)者共同努力不斷改進。

       隨著綠色多肽工藝的開發(fā)和應(yīng)用、人工智能自動化控制技術(shù)等新技術(shù)與多肽合成工藝的有效融合，多肽制藥工藝將得到進一步發(fā)展和提高，助推更多的多肽藥物進入市場造福更多大眾。