淺析：尚無(wú)藥物上市的「IAP抑制劑」

       細(xì)胞凋亡抑制蛋白（IAP，Inhibitor of Apoptosis）是功能上和結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)家族，其作為程序性細(xì)胞死亡（細(xì)胞凋亡）的內(nèi)源性抑制劑。

       IAP是細(xì)胞凋亡和促存活信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因子，其失調(diào)通常與腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng)息息相關(guān)。

       IAP抑制劑可分為Smac模擬物和非肽類小分子兩類。目前，全球尚無(wú)IAP抑制劑獲批上市，IAP不僅可以作為藥物靶標(biāo)，也可以作為E3連接酶設(shè)計(jì)特異性和非遺傳IAP依賴性蛋白消除劑SNIPERs降解靶標(biāo)蛋白，還可以連接其它E3連接酶配體合成異型雙功能降解劑。

       01

       IAP結(jié)構(gòu)與功能

       細(xì)胞凋亡或程序性死亡是一種天然的細(xì)胞周期過(guò)程，旨在消除體內(nèi)不需要或受損的細(xì)胞。在健康組織中，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白間存在良好的調(diào)節(jié)平衡，二者共同作用調(diào)控細(xì)胞凋亡。但是，癌細(xì)胞通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)、預(yù)后不良和耐藥性等問(wèn)題。

       IAP通過(guò)多種機(jī)制，在調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

       哺乳動(dòng)物IAP家族中有八個(gè)成員：細(xì)胞IAP1（c-IAP1）、X染色體連接IAP（XIAP）、細(xì)胞IAP2（c-IAP2）、神經(jīng)元IAP（NAIP）、泛素結(jié)合BIR結(jié)構(gòu)域酶（BRUCE）、存活蛋白、IAP樣蛋白2（ILP2）和黑色素瘤IAP（ML-IAP）[1]。

       IAP由三個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域（BIR1至BIR3）、一個(gè)泛素相關(guān)（UBA）結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C末端RING結(jié)構(gòu)域組成。cIAP1/2還包含一個(gè)CARD域（圖1）[2,3]。

       圖1. IAP蛋白的結(jié)構(gòu)域組織

       XIAP是唯一直接與半胱天冬酶3/7結(jié)合并抑制其活性的IAP（圖2A）。Smac/Diablo和SM涉及不同細(xì)胞途徑的靶向同源IAPs。半胱天冬酶/IAP直接結(jié)合第二線粒體衍生的半胱天冬酶激活劑（Smac/Diablo），激發(fā)了大量化合物的設(shè)計(jì)和合成，稱為Smac模擬物（SMs）。

       XIAP抑制劑（半胱天冬酶-9，綠色表面）和效應(yīng)半胱天冬酶（半胱天冬酶-3和-7，洋紅色表面），與 II 類BIR（分別為BIR3和BIR2）相互作用。

       特別是，II型BIR顯示為一個(gè)保守的IBM凹槽（藍(lán)色縮放視圖中的區(qū)域），其中包含在球體中報(bào)告的N端IAP結(jié)合基序（IBM）。Smac/Diablo在壓力刺激下從線粒體釋放，取代通過(guò)暴露N末端四肽Ala-Val-Pro-Ile（AVPI）（橙色球體）的半胱天冬酶，這是SM的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)。圖2B顯示cIAPs作為無(wú)活性單體存在于細(xì)胞質(zhì)中[3]。

       圖2. Smac/Diablo和SM涉及不同細(xì)胞途徑的靶向同源IAPs

       治療誘導(dǎo)cIAP1/2的二聚化和快速自泛素化，可以導(dǎo)致其降解。除了對(duì)半胱天冬酶的抑制作用外，IAPs還參與腫瘤壞死因子-α（TNFα）誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡信號(hào)傳導(dǎo)。

       02

       IAP拮抗劑

       最初研究者開(kāi)發(fā)了一種IAP拮抗劑，靈感來(lái)自于AVPI肽，稱為第二線粒體衍生的半胱天冬酶激活劑（SMAC）的N末端序列。SMAC干擾XIAP與半胱天冬酶-9相互作用，抑制細(xì)胞凋亡。SMAC與cIAP1/2相互作用，并誘導(dǎo)構(gòu)象變化，導(dǎo)致自我泛素化和自我分解。

       這些結(jié)果表明，cIAP1/XIAP的雙重拮抗劑可通過(guò)外源性和內(nèi)源性途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。早期擬肽IAP拮抗劑已從單價(jià)形式演變?yōu)槎r(jià)形式，以最大限度地提高其功效（圖3）[4]。

       近期，Astex Pharmaceuticals推出了第一個(gè)非肽型IAP拮抗劑，稱為tolinapant，目前作為晚期實(shí)體瘤和淋巴瘤的靶標(biāo)進(jìn)行臨床試驗(yàn)（圖3，NCT02503423），加強(qiáng)了IAP作為抗癌治療靶點(diǎn)的重要性[5]。

       圖3. 近期開(kāi)發(fā)的第二種線粒體衍生的半胱天冬酶激活劑（SMAC）的凋亡蛋白（IAP）拮抗劑的模擬抑制劑

       03

       E3連接酶

       E3連接酶可以分成RING、HECT、RBR等家族，每個(gè)家族下又有其他分型。目前已知的E3連接酶約有600多種，但在PROTAC中常用配體的相關(guān)E3連接酶只有 CRBN、VHL、IAP、MDM2等四種（圖4），此外還有DCF15、RNF114、DCAF16、KEAP1、FEM1B等僅有少數(shù)配體報(bào)導(dǎo)的E3連接酶。

       圖4. 常見(jiàn)的E3連接酶配體

       除此之外，也已開(kāi)發(fā)出了很多新型結(jié)構(gòu)E3連接酶配體，如圖5所示新型CRBN配體[6]。

       圖5. 新型CRBN配體

       近些年來(lái)，人們也在開(kāi)發(fā)不同的E3連接酶用于PROTAC設(shè)計(jì)。如2021年，Ishida等人專注于發(fā)現(xiàn)用于PROTAC的新型E3泛素連接酶的新方法。這些方法包括分子建模方法，例如基于晶體學(xué)數(shù)據(jù)收集信息的SBDD和FBDD方法、基于活性的蛋白質(zhì)分析（ABPP）篩查或表型篩查。通過(guò)這些方法，他們發(fā)現(xiàn)一些可以用于PROTACs設(shè)計(jì)的E3連接酶（圖6）[6]。

       圖6. 尚未探索用于PROTAC應(yīng)用的E3泛素連接酶列表

       04

       基于IAP設(shè)計(jì)的SNIPERs

       基于IAP抑制劑可以設(shè)計(jì)SNIPERs，SNIPERs與PROTAC相似，可以招募E3連接酶來(lái)降解靶標(biāo)蛋白，只是用的E3連接酶配體是IAP抑制劑。

       烏苯美司（BS）及其衍生物，顯示出與IAP的BIR3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性，因此誘導(dǎo)自我泛素化的蛋白酶體降解，或者使其它蛋白泛素化從而被降解。

       由于IAP具有如此高的親和力，人們可以基于BS結(jié)構(gòu)衍生得到SNIPERs（如圖7A所示）。Natio等人報(bào)道，甲基烏苯美司（MeBS）可以增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)癌癥藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的化學(xué)敏感性，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。

       機(jī)理研究揭示，MeBS誘導(dǎo)RING依賴性自身泛素化和通過(guò)與cIAP1的第三個(gè)BIR域結(jié)合，誘導(dǎo)cIAP1蛋白酶體降解（如圖7B所示）。SAR研究表明，即使用更龐大的基團(tuán)取代羧酸甲酯，cIAP1水平仍能保持降低，表明MeBS的羧酸甲酯基團(tuán)沒(méi)有與cIAP1形成相互作用。這些結(jié)果促使Natio等人擴(kuò)展分子框架以設(shè)計(jì)SNIPER，從甲基的位置連接接頭，該接頭進(jìn)一步連接到對(duì)靶蛋白具有內(nèi)在活性的分子上，如圖7C所示。

       圖7.（A）烏苯美司及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)；（B）報(bào)道的cIAP降解機(jī)制；（C） SNIPERs作用機(jī)制

       除了烏苯美司及其衍生物之外，化合物1（圖3）也被選為開(kāi)發(fā)降解劑的IAP抑制劑，因?yàn)樗乾F(xiàn)有二價(jià)IAP拮抗劑的一部分（圖3），如化合物20通過(guò)泛素蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）招募IAP來(lái)降解RIPK2（圖8）[8]。

       圖8. 基于IAP設(shè)計(jì)的PIPK2的PROTAC

       05

       異型雙功能泛IAP降解劑

       E3連接酶不僅可以被用來(lái)設(shè)計(jì)PROTACs或SNIPERs，也可以作為靶標(biāo)蛋白被降解，之前也已經(jīng)有很多異型雙功能降解劑被報(bào)道，如連接CRBN配體和VHL配體招募E3連接酶VHL，來(lái)降解CRBN蛋白的降解劑CRBN-6-5-5-VHL，或連接MDM2配體和CRBN配體招募E3連接酶CRBN，來(lái)降解MDM2蛋白的降解劑MD-224等（圖9）[9]。

       圖9. 異型雙功能E3連接酶降解劑

       近期，Seulki等人在EJMC上報(bào)道了一類異型雙功能泛IAP降解劑，他們合成了十幾個(gè)化合物，并評(píng)估它們?cè)贛CF-7細(xì)胞中對(duì)cIAP1、cIAP2和XIAP的降解作用，最終發(fā)現(xiàn)化合物12（圖10）在0.1 mM和1 mM濃度時(shí)，對(duì)cIAP1、cIAP2和XIAP都有超過(guò)95%的降解（除了在0.1 mM對(duì)cIAP1有87%的降解）[4]。

       圖10. 化合物12（TD-1092）的結(jié)構(gòu)和降解活性

       而且，Yuen在JMC也發(fā)表了連接IAP配體和VHL配體或者CRBN配體，來(lái)設(shè)計(jì)異型雙功能泛IAP降解劑（圖11）[9]。

       圖11. 異型雙功能E3連接酶降解劑

       他們?cè)O(shè)計(jì)了三種不同系列的異型雙功能降解劑，其中兩種與VHL配體不同位置連接而得，另一種與CRBN配體連接，從圖12可以看出大部分化合物對(duì)三種IAP蛋白有很明顯的降解功能。

       圖12. 三種不同類型的異型雙功能降解劑

       他們最終發(fā)現(xiàn)化合物9對(duì)三種IAP蛋白（cIAP1、cIAP2和XIAP）都有很明顯的降解作用，而且它對(duì)多種細(xì)胞系有很明顯的抑制生長(zhǎng)作用（圖13）。

       圖13. 化合物9的結(jié)構(gòu)與活性

       06

       小結(jié)

       細(xì)胞凋亡或程序性死亡是一種天然的細(xì)胞周期過(guò)程，旨在消除體內(nèi)不需要或受損的細(xì)胞。在健康組織中，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白間存在良好的調(diào)節(jié)平衡，二者共同作用調(diào)控細(xì)胞凋亡。但是，癌細(xì)胞通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)、預(yù)后不良和耐藥性等問(wèn)題。

       據(jù)預(yù)測(cè)到2030年，細(xì)胞凋亡市場(chǎng)規(guī)模有望達(dá)到36.3億美元，2022-2030年復(fù)合增長(zhǎng)率達(dá)31.7%。

       細(xì)胞凋亡抑制蛋白是功能上和結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)家族，其作為程序性細(xì)胞死亡（細(xì)胞凋亡）的內(nèi)源性抑制劑。IAP可直接結(jié)合含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase），抑制Caspase的活性，預(yù)防細(xì)胞凋亡。

       IAP抑制劑可分為Smac模擬物和非肽類小分子兩類，其中Smac模擬物可依據(jù)結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目分為單體和二聚體抑制劑，包括LCL161、AT-406等；二聚體抑制劑可激活Caspase-3/7/9的活性，達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的目的，包括APG-1387等。

       目前全球尚無(wú)IAP抑制劑獲批上市，IAP不僅可以作為藥物靶標(biāo)，也可以作為E3連接酶設(shè)計(jì)SNIPERs降解靶標(biāo)蛋白（化合物20通過(guò)UPS系統(tǒng)招募IAP來(lái)降解RIPK2），而且還可以連接其它E3連接酶配體合成異型雙功能降解劑（如異型雙功能泛IAP降解劑9和12）。