綜述 | mRNA藥物全面解讀

       伴隨著全球的新冠大流行，新冠疫苗備受關注。目前市面上的新冠疫苗有三個類型：傳統(tǒng)滅活疫苗、腺病毒載體疫苗以及信使RNA (mRNA)疫苗。傳統(tǒng)的滅活疫苗我們比較了解，它是將經(jīng)過處理、沒有傳染性和致病性的病原體注入人體，讓免疫系統(tǒng)認識這種病原體，從而達到預防的目的。腺病毒載體疫苗是用另外一種非復制型的病毒將想要免疫的病原體DNA注入人體。相較于這兩種疫苗，mRNA疫苗更具設計與制造的簡便性、固有的免疫原性、快速量產(chǎn)性等優(yōu)勢。

       而且隨著生物技術和分子醫(yī)學的快速發(fā)展，mRNA引入人體作為疫苗或治療劑能夠產(chǎn)生幾乎所有功能性蛋白，這代表著一個精準醫(yī)學領域正在崛起，其在預防和治療許多難治性疾病方面前景廣闊。因此，小編今天和大家分享之前發(fā)表在Signal Transduction and Targeted Therapy雜志上（IF:18.817）的關于mRNA治療的綜述，為大家進一步介紹mRNA治療的現(xiàn)狀。

       基于mRNA的治療：對抗疾病的強大和通用工具

       01

       mRNA的設計與制造

       mRNA治療的發(fā)展主要包括mRNA的設計、合成、包封、藥效學、藥代動力學、體內和體外安全性評價、生產(chǎn)和臨床試驗(圖2，表1)。其中mRNA的設計和合成是關鍵步驟，想要獲得高度生物活性RNA也通常依賴于可靠的設計。因此，在這一部分，作者重點關注并討論了mRNA設計和制造。并從以下幾點進行了介紹：

       mRNA的結構成分

       要了解mRNA治療，首先要了解mRNA結構。mRNA是由轉錄過程產(chǎn)生的，真核生物中RNA聚合酶在體內將基因轉化為初級mRNA轉錄本時合成前體mRNA，通過加工進一步成為成熟mRNA 。成熟mRNA包括編碼區(qū)、非編碼區(qū)（UTR）、poly(A)尾和5′帽結構，它們可以被核糖體識別并被tRNA攜帶產(chǎn)生蛋白質。

       與DNA一樣，mRNA中的遺傳信息包含在核苷酸序列中，這些核苷酸排列成密碼子，每個密碼子由三個核糖核苷酸組成。因此，通過刺激真核細胞mRNA合成機制來完成體外RNA轉錄，能夠確保mRNA在體內的表達(圖3)。所以mRNA的優(yōu)化對于成功的mRNA治療至關重要。

       mRNA翻譯和衰變

       真核mRNA翻譯起始是一個精細調控的過程，涉及到組裝一個多蛋白及RNA復合物，指導核糖體到起始密碼子。而mRNA在核糖體中會被解碼，產(chǎn)生特定的氨基酸鏈。研究發(fā)現(xiàn)翻譯過程和mRNA衰變過程之間存在一種平衡（圖4）。先前的研究表明，結構元件與mRNA的衰變密切相關，尤其是5 '帽和poly(A)尾。基于這些功能元件的重要性，有大量研究集聚焦于mRNA結構的優(yōu)化，如開發(fā)一系列5 '帽類似物、改變poly(a)尾長度等。

       mRNA設計

       這一部對mRNA設計進行了介紹。首先介紹的是5 '帽。5 '帽位于mRNA的5 '端，甲基化程度不同（圖5），許多mRNA結構優(yōu)化策略致力于優(yōu)化帽類似物。接著介紹的是poly(A)尾。Poly(A)尾通常由10-250個腺嘌呤核糖核苷酸組成。Poly(A)尾是mRNA的動態(tài)添加物，其的長度對mRNA翻譯效果和蛋白表達起著至關重要的調控作用。

       此外，作者也介紹了5′-UTRs和3′-UTRs。mRNA 3′和5′末端的UTRs不編碼蛋白但在調控mRNA翻譯和蛋白表達中起重要作用。UTRs參與mRNA的亞細胞定位，調節(jié)mRNA的翻譯效率和穩(wěn)定性。5′-UTRs和3′-UTRs共同調控蛋白質的表達水平，5′-UTRs主要參與啟動翻譯過程，而3′-UTRs主要影響mRNA的穩(wěn)定性和半衰期。作者也對開放閱讀框（ORF）進行了介紹，ORF的設計主要集中在密碼子的優(yōu)化和功能肽的引入以及復制過程。

       RNA化學式設計

       這一部分作者主要介紹了兩類RNA。首先是自擴增RNA (Self-amplifying RNA, saRNA)：與傳統(tǒng)mRNA相比，saRNA是另一種結構不同的mRNA分子。saRNA主要來源于甲病毒，通過替換病毒結構蛋白的基因序列編碼來構建。因此，saRNA可以利用甲病毒的先天特性，以一種有效的方式產(chǎn)生大量感興趣的蛋白質。

       其次是環(huán)狀RNA、非編碼RNA和競爭性內源RNA：環(huán)狀RNA (circRNAs)是單鏈、共價閉合的RNA分子，在從病毒到哺乳動物中普遍存在。CircRNAs可作為蛋白質誘餌、支架和招募者，通過充當轉錄調控因子、microRNA海綿和蛋白質模板發(fā)揮生物功能。環(huán)狀RNA 獨特的結構使其具有更大的穩(wěn)定性、更長的半衰期和更大的RNase R抗性，這是線性mRNA缺乏和期望的。

       mRNA的制造

       針對mRNA的制造，作者主要對RNA的合成與優(yōu)化進行了介紹。體外轉錄(IVT) mRNA是用線性化質粒DNA模板或PCR模板進行的，需要至少一個啟動子和相應的mRNA構建序列。獲得mRNA的過程需要加帽，通常采用兩種方法：共轉錄加帽和轉錄后加帽。而IVT mRNA的Poly(A)尾通常編碼在DNA模板中或通過酶促作用附著在IVT mRNA上。當poly(A)尾延伸編碼在模板載體中時，會出現(xiàn)懸臂，這妨礙了IVT mRNA的翻譯效果，需要通過IIS型限制性內切酶替換II型限制性內切酶來避免。

       mRNA純化

       IVT mRNA合成后會與RNA聚合酶和DNA模板混合，因此純化IVT mRNA是必要的，包括去除免疫刺激污染物，游離核糖核苷酸，短mRNA和DNA模板。一般情況下，會用DNA酶降解多余的DNA模板。商業(yè)純化試劑盒則用于純化和分離合成的mRNA，然后乙醇或異丙醇沉淀可以去除大部分污染物，以獲得高純度的mRNA，然后用高濃度的LiCl或醇基沉淀、色譜法，或從硅膠膜柱中洗脫，可以去除蛋白質、游離核苷酸及其他成分，但不能去除dsRNA雜質。為了去除轉錄反應液中的dsRNA污染物，一種新的純化方法RNase III被提出，其能夠顯著降低mRNA的免疫原性。

       綜上所述，純化mRNA的方法多種多樣，純度要求和尺度不同，應根據(jù)研究或應用的目的而定。顯然，無論使用何種方法進行純化，嚴格的mRNA質量控制是確保mRNA治療最大效益的核心。

       02

       mRNA運載系統(tǒng)

       mRNA的傳遞仍然是當前基于mRNA治療的一個巨大挑戰(zhàn)。因此在文章的第二大部分作者列出了多種mRNA運載系統(tǒng)，并從多個角度對運載系統(tǒng)進行了介紹。

       1.mRNA運載體

       文章首先就對運載mRNA的脂質納米粒進行介紹（圖6）。首先介紹的是陽離子固體脂質納米粒，陽離子脂類廣泛用于mRNA傳遞。接著作者又介紹了可電離脂質納米顆粒，有研究已經(jīng)將可電離的氨基脂質Dlin-MC3- DMA (MC3)用于臨床治療。接著介紹的是具有免疫刺激作用的脂質納米顆粒，有研究開發(fā)了具有環(huán)狀氨基頭基團的脂質，可激活細胞內STING通路，會顯著延長了生存期，增強了抗腫瘤療效。

       其次是，聚合物納米顆粒：聚合化合物及其衍生物可以由天然或合成材料合成，具有多種可能的結構和特性。其中PEI是最有效的非病毒基因載體之一。此外還有，陽離子納米乳劑：1990年，CNEs被提出作為一種潛在的核酸輸送系統(tǒng)，已被證明可以有效地輸送核酸用于各種疾病的治療。其中在配方中加入陽離子脂質是通過靜電作用進行核酸絡合的必要條件，這對于提高核酸的穩(wěn)定性和轉染效率，防止核酸被核酸酶降解也是必不可少的。

       最后是，其他mRNA傳遞系統(tǒng)：也有一些其他類型的載體被開發(fā)用于傳遞mRNA，其中包括精蛋白濃縮mRNA、外泌體、細胞外囊泡(ev)、介孔二氧化硅、CaP等。

       2.影響mRNA運載的其他因素

       接下來文章對影響mRNA運載系統(tǒng)的其他因素進行了介紹。其中包括：體外和體內mRNA傳遞的屏障，mRNA傳遞的屏障一直是該領域思考的重點，研究者通過增加細胞攝取，促進溶酶體逃逸，加速翻譯來最大限度地提供mRNA。研究發(fā)現(xiàn)mRNA在納米顆粒的幫助下進入細胞質涉及多個步驟:包括內吞作用、溶酶體逃逸和mRNA釋放，其中細胞膜是細胞內運輸?shù)囊粋€動態(tài)和強大的屏障。而納米顆粒會通過多種機制與細胞膜相互作用。

       此外，了解mRNA的細胞攝取機制是mRNA高效傳遞的前提。mRNA傳遞系統(tǒng)的佐劑活性：陽離子脂質體本身作為佐劑，其主要功能是保護抗原不被清除，并將抗原傳遞給專業(yè)的APCs。管理路徑對傳遞效率的影響：給藥途徑在mRNA給藥系統(tǒng)中起著至關重要的作用，因為一些特定的疾病需要特定的給藥途徑，盡管靜脈給藥可以滿足大多數(shù)疾病的需要，但肺部疾病等則宜采用吸入或氣管內給藥。此外，不同給藥載體在不同給藥路徑下的分布或表達也不同。

       03

       mRNA治療的應用

       基于mRNA的治療有望成為多種難治性疾病的有力治療手段，包括傳染性疾病、代謝性遺傳疾病、癌癥、心腦血管疾病和其他疾病(圖7，表2)。因此，在這一部分作者對mRNA治療的應用進行了詳細介紹。主要包括以下幾種：

       1.直接基于編碼分子的mRNA療法

       以mRNA為基礎的免疫治療通過表達抗原然后啟動免疫反應，被定義為一種間接治療，其不以病毒或腫瘤細胞的mRNA編碼治療蛋白。而mRNA療法通過傳遞基于mRNA的功能性蛋白直接治療疾病則是一種直接策略，這些功能蛋白主要包括缺失或下調內源性蛋白、功能性外源蛋白或抗體，以及用于基因編輯工具的蛋白。

       2.基于mRNA單克隆抗體及免疫療法

       以抗體為基礎的藥物在生物制藥領域取得了快速的進展，但單克隆抗體的脆弱特性以及高昂的生產(chǎn)、儲存、運輸和分銷成本限制了其在世界范圍內的應用。核酸編碼的單克隆抗體，特別是基于mRNA的單克隆抗體，則為提高抗體治療效果帶來了很大希望。

       此外，作者回顧了基于mRNA的藥物應用，重點是預防和治療傳染病和癌癥的疫苗的臨床試驗(圖8)。其中抗傳染病的mRNA疫苗中最經(jīng)典的例子是SARS-CoV-2 mRNA疫苗:2019年SARS-CoV-2出現(xiàn)，并在全球范圍內引發(fā)大流行，首 個COVID-19疫苗被FDA批準緊急使用授權（圖9）。

       除此，也包括流感病毒mRNA疫苗、HIV mRNA疫苗、呼吸道合胞體病毒（RSV）mRNA疫苗、單純性皰疹病毒(HSV) mRNA疫苗、水痘帶狀皰疹病毒(VZV) mRNA疫苗、人巨細胞病毒(HCMV)mRNA疫苗、狂犬病毒mRNA疫苗、登革病毒mRNA疫苗。而癌癥疫苗則包括;黑色素瘤疫苗、惡性膠質瘤疫苗、急性髓性白血病疫苗、腎細胞癌疫苗等。

       mRNA癌癥疫苗的耐受性及安全性

       研究發(fā)現(xiàn)新表位可以繞過具有高免疫原性的中心耐受性，因為它們從不出現(xiàn)在正常組織中，并在癌細胞中產(chǎn)生基因突變的積累。因此，新表位被用于克服癌癥疫苗的中心耐受性和解決腫瘤異質性的問題。而且mRNA疫苗也具有足夠的安全性，其不良事件一般為輕至中度，包括注射部位反應，如疼痛、腫脹、紅斑和流感樣疾病，如疲勞、肌痛、發(fā)熱和寒戰(zhàn)。

       4.mRNA疫苗佐劑

       佐劑對于基于mRNA的治療至關重要，尤其是mRNA疫苗，它可以放大和直接免疫應答。FDA批準了幾種用于人體的佐劑，包括鋁鹽、MF59、AS01、AS03、AS04等。

       5.基于mRNA的蛋白質替代療法

       蛋白質替代處理在用有利蛋白替代缺失或缺陷蛋白方面有著廣泛的應用?；趍RNA的治療方法已成為蛋白質替代治療的新支柱，在多個領域得到了廣泛的探索，包括心臟病、肺部疾病、血液系統(tǒng)疾病、代謝性疾病、癌癥、骨科疾病、神經(jīng)源性疾病、肌肉萎縮等。

       6.mRNA編碼肽及蛋白質

       mRNA編碼的肽和蛋白的功能是選擇靶向細胞治療藥物的關鍵因素，直接影響mRNA的治療設計。對于需要翻譯后修飾以組裝成功能類型多肽的細胞，需要使用適當?shù)牡鞍踪|轉化酶或內蛋白酶來精確傳遞。而蛋白質則需要分泌到細胞外才能發(fā)揮其功能。因此，mRNA需要被傳遞到具有自然分泌功能的細胞中，否則需要將相應信號肽mRNA序列插入到分泌蛋白的ORF附近。

       7.基于mRNA的基因編輯療法及CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)

       mRNA被廣泛用于傳遞可編程核酸酶。mRNA具有瞬時表達、無突變風險的特點，是基因編輯治療中極具吸引力的方法，目前，多個基于mRNA基因編輯的臨床試驗正在進行中。此外，人工核酸內切酶的發(fā)展帶動了基于mRNA的基因編輯技術的高速發(fā)展。mRNA藥物通過編碼人工核酸內切酶，如ZFNs、TALENs和最近的CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)，調節(jié)細胞基因組信息。

       8.基于mRNA的治療

       在文章最后作者對基于mRNA的治療進行了介紹，主要包括基于mRNA的T淋巴細胞治療、基于mRNA的自體T細胞治療、基于mRNA的CD4+ T細胞治療、基于mRNA的干細胞治療、基于mRNA的多能干細胞(iPS)治療及基于mRNA藥物的聯(lián)合治療。

       小結

       到這里這篇文章的主要內容就介紹完了，文章對基于mRNA的治療工具進行了全面的介紹，從mRNA的結構、制造、傳遞到應用，全文參考文獻近600篇，內容非常豐富。

       目前mRNA治療正在快速崛起，是一個非常有前景的研究領域，由于其在靈活性、成本和開發(fā)速度方面的優(yōu)勢，該技術為傳染病和個性化藥物提供了巨大的好處和潛力。當然，要充分發(fā)揮這項技術的潛力，仍然需要克服包括缺乏擴大mRNA過程的經(jīng)驗和知識及靶向遞送技術等挑戰(zhàn)。