淺析：尚無藥物上市的「IAP抑制劑」

       細(xì)胞凋亡抑制蛋白（IAP，Inhibitor of Apoptosis）是功能上和結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)家族，其作為程序性細(xì)胞死亡（細(xì)胞凋亡）的內(nèi)源性抑制劑。

       IAP是細(xì)胞凋亡和促存活信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因子，其失調(diào)通常與腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng)息息相關(guān)。

       IAP抑制劑可分為Smac模擬物和非肽類小分子兩類。目前，全球尚無IAP抑制劑獲批上市，IAP不僅可以作為藥物靶標(biāo)，也可以作為E3連接酶設(shè)計(jì)特異性和非遺傳IAP依賴性蛋白消除劑SNIPERs降解靶標(biāo)蛋白，還可以連接其它E3連接酶配體合成異型雙功能降解劑。

       IAP結(jié)構(gòu)與功能

       細(xì)胞凋亡或程序性死亡是一種天然的細(xì)胞周期過程，旨在消除體內(nèi)不需要或受損的細(xì)胞。在健康組織中，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白間存在良好的調(diào)節(jié)平衡，二者共同作用調(diào)控細(xì)胞凋亡。但是，癌細(xì)胞通過上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)、預(yù)后不良和耐藥性等問題。

       IAP通過多種機(jī)制，在調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

       哺乳動(dòng)物IAP家族中有八個(gè)成員：細(xì)胞IAP1（c-IAP1）、X染色體連接IAP（XIAP）、細(xì)胞IAP2（c-IAP2）、神經(jīng)元IAP（NAIP）、泛素結(jié)合BIR結(jié)構(gòu)域酶（BRUCE）、存活蛋白、IAP樣蛋白2（ILP2）和黑色素瘤IAP（ML-IAP）[1]。

       IAP由三個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域（BIR1至BIR3）、一個(gè)泛素相關(guān)（UBA）結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C末端RING結(jié)構(gòu)域組成。cIAP1/2還包含一個(gè)CARD域（圖1）[2,3]。

       圖1. IAP蛋白的結(jié)構(gòu)域組織

       XIAP是唯一直接與半胱天冬酶3/7結(jié)合并抑制其活性的IAP（圖2A）。Smac/Diablo和SM涉及不同細(xì)胞途徑的靶向同源IAPs。半胱天冬酶/IAP直接結(jié)合第二線粒體衍生的半胱天冬酶激活劑（Smac/Diablo），激發(fā)了大量化合物的設(shè)計(jì)和合成，稱為Smac模擬物（SMs）。

       XIAP抑制劑（半胱天冬酶-9，綠色表面）和效應(yīng)半胱天冬酶（半胱天冬酶-3和-7，洋紅色表面），與 II 類BIR（分別為BIR3和BIR2）相互作用。

       特別是，II型BIR顯示為一個(gè)保守的IBM凹槽（藍(lán)色縮放視圖中的區(qū)域），其中包含在球體中報(bào)告的N端IAP結(jié)合基序（IBM）。Smac/Diablo在壓力刺激下從線粒體釋放，取代通過暴露N末端四肽Ala-Val-Pro-Ile（AVPI）（橙色球體）的半胱天冬酶，這是SM的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)。圖2B顯示cIAPs作為無活性單體存在于細(xì)胞質(zhì)中[3]。

       圖2. Smac/Diablo和SM涉及不同細(xì)胞途徑的靶向同源IAPs

       治療誘導(dǎo)cIAP1/2的二聚化和快速自泛素化，可以導(dǎo)致其降解。除了對(duì)半胱天冬酶的抑制作用外，IAPs還參與腫瘤壞死因子-α（TNFα）誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡信號(hào)傳導(dǎo)。

       IAP拮抗劑

       最初研究者開發(fā)了一種IAP拮抗劑，靈感來自于AVPI肽，稱為第二線粒體衍生的半胱天冬酶激活劑（SMAC）的N末端序列。SMAC干擾XIAP與半胱天冬酶-9相互作用，抑制細(xì)胞凋亡。SMAC與cIAP1/2相互作用，并誘導(dǎo)構(gòu)象變化，導(dǎo)致自我泛素化和自我分解。

       這些結(jié)果表明，cIAP1/XIAP的雙重拮抗劑可通過外源性和內(nèi)源性途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。早期擬肽IAP拮抗劑已從單價(jià)形式演變?yōu)槎r(jià)形式，以最大限度地提高其功效（圖3）[4]。

       近期，Astex Pharmaceuticals推出了第一個(gè)非肽型IAP拮抗劑，稱為tolinapant，目前作為晚期實(shí)體瘤和淋巴瘤的靶標(biāo)進(jìn)行臨床試驗(yàn)（圖3，NCT02503423），加強(qiáng)了IAP作為抗癌治療靶點(diǎn)的重要性[5]。

       圖3. 近期開發(fā)的第二種線粒體衍生的半胱天冬酶激活劑（SMAC）的凋亡蛋白（IAP）拮抗劑的模擬抑制劑

       E3連接酶

       E3連接酶可以分成RING、HECT、RBR等家族，每個(gè)家族下又有其他分型。目前已知的E3連接酶約有600多種，但在PROTAC中常用配體的相關(guān)E3連接酶只有 CRBN、VHL、IAP、MDM2等四種（圖4），此外還有DCF15、RNF114、DCAF16、KEAP1、FEM1B等僅有少數(shù)配體報(bào)導(dǎo)的E3連接酶。

       圖4. 常見的E3連接酶配體

       除此之外，也已開發(fā)出了很多新型結(jié)構(gòu)E3連接酶配體，如圖5所示新型CRBN配體[6]。

       圖5. 新型CRBN配體

       近些年來，人們也在開發(fā)不同的E3連接酶用于PROTAC設(shè)計(jì)。如2021年，Ishida等人專注于發(fā)現(xiàn)用于PROTAC的新型E3泛素連接酶的新方法。這些方法包括分子建模方法，例如基于晶體學(xué)數(shù)據(jù)收集信息的SBDD和FBDD方法、基于活性的蛋白質(zhì)分析（ABPP）篩查或表型篩查。通過這些方法，他們發(fā)現(xiàn)一些可以用于PROTACs設(shè)計(jì)的E3連接酶（圖6）[6]。

       圖6. 尚未探索用于PROTAC應(yīng)用的E3泛素連接酶列表

       基于IAP設(shè)計(jì)的SNIPERs

       基于IAP抑制劑可以設(shè)計(jì)SNIPERs，SNIPERs與PROTAC相似，可以招募E3連接酶來降解靶標(biāo)蛋白，只是用的E3連接酶配體是IAP抑制劑。

       烏苯美司（BS）及其衍生物，顯示出與IAP的BIR3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性，因此誘導(dǎo)自我泛素化的蛋白酶體降解，或者使其它蛋白泛素化從而被降解。

       由于IAP具有如此高的親和力，人們可以基于BS結(jié)構(gòu)衍生得到SNIPERs（如圖7A所示）。Natio等人報(bào)道，甲基烏苯美司（MeBS）可以增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)癌癥藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的化學(xué)敏感性，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。

       機(jī)理研究揭示，MeBS誘導(dǎo)RING依賴性自身泛素化和通過與cIAP1的第三個(gè)BIR域結(jié)合，誘導(dǎo)cIAP1蛋白酶體降解（如圖7B所示）。SAR研究表明，即使用更龐大的基團(tuán)取代羧酸甲酯，cIAP1水平仍能保持降低，表明MeBS的羧酸甲酯基團(tuán)沒有與cIAP1形成相互作用。這些結(jié)果促使Natio等人擴(kuò)展分子框架以設(shè)計(jì)SNIPER，從甲基的位置連接接頭，該接頭進(jìn)一步連接到對(duì)靶蛋白具有內(nèi)在活性的分子上，如圖7C所示。

       圖7.（A）烏苯美司及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)；（B）報(bào)道的cIAP降解機(jī)制；（C） SNIPERs作用機(jī)制

       除了烏苯美司及其衍生物之外，化合物1（圖3）也被選為開發(fā)降解劑的IAP抑制劑，因?yàn)樗乾F(xiàn)有二價(jià)IAP拮抗劑的一部分（圖3），如化合物20通過泛素蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）招募IAP來降解RIPK2（圖8）[8]。

       圖8. 基于IAP設(shè)計(jì)的PIPK2的PROTAC

       異型雙功能泛IAP降解劑

       E3連接酶不僅可以被用來設(shè)計(jì)PROTACs或SNIPERs，也可以作為靶標(biāo)蛋白被降解，之前也已經(jīng)有很多異型雙功能降解劑被報(bào)道，如連接CRBN配體和VHL配體招募E3連接酶VHL，來降解CRBN蛋白的降解劑CRBN-6-5-5-VHL，或連接MDM2配體和CRBN配體招募E3連接酶CRBN，來降解MDM2蛋白的降解劑MD-224等（圖9）[9]。

       圖9. 異型雙功能E3連接酶降解劑

       近期，Seulki等人在EJMC上報(bào)道了一類異型雙功能泛IAP降解劑，他們合成了十幾個(gè)化合物，并評(píng)估它們?cè)贛CF-7細(xì)胞中對(duì)cIAP1、cIAP2和XIAP的降解作用，最終發(fā)現(xiàn)化合物12（圖10）在0.1 mM和1 mM濃度時(shí)，對(duì)cIAP1、cIAP2和XIAP都有超過95%的降解（除了在0.1 mM對(duì)cIAP1有87%的降解）[4]。

       圖10. 化合物12（TD-1092）的結(jié)構(gòu)和降解活性

       而且，Yuen在JMC也發(fā)表了連接IAP配體和VHL配體或者CRBN配體，來設(shè)計(jì)異型雙功能泛IAP降解劑（圖11）[9]。

       圖11. 異型雙功能E3連接酶降解劑

       他們?cè)O(shè)計(jì)了三種不同系列的異型雙功能降解劑，其中兩種與VHL配體不同位置連接而得，另一種與CRBN配體連接，從圖12可以看出大部分化合物對(duì)三種IAP蛋白有很明顯的降解功能。

       圖12. 三種不同類型的異型雙功能降解劑

       他們最終發(fā)現(xiàn)化合物9對(duì)三種IAP蛋白（cIAP1、cIAP2和XIAP）都有很明顯的降解作用，而且它對(duì)多種細(xì)胞系有很明顯的抑制生長(zhǎng)作用（圖13）。

       圖13. 化合物9的結(jié)構(gòu)與活性

       小結(jié)

       細(xì)胞凋亡或程序性死亡是一種天然的細(xì)胞周期過程，旨在消除體內(nèi)不需要或受損的細(xì)胞。在健康組織中，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白間存在良好的調(diào)節(jié)平衡，二者共同作用調(diào)控細(xì)胞凋亡。但是，癌細(xì)胞通過上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)、預(yù)后不良和耐藥性等問題。

       據(jù)預(yù)測(cè)到2030年，細(xì)胞凋亡市場(chǎng)規(guī)模有望達(dá)到36.3億美元，2022-2030年復(fù)合增長(zhǎng)率達(dá)31.7%。

       細(xì)胞凋亡抑制蛋白是功能上和結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)家族，其作為程序性細(xì)胞死亡（細(xì)胞凋亡）的內(nèi)源性抑制劑。IAP可直接結(jié)合含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase），抑制Caspase的活性，預(yù)防細(xì)胞凋亡。

       IAP抑制劑可分為Smac模擬物和非肽類小分子兩類，其中Smac模擬物可依據(jù)結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目分為單體和二聚體抑制劑，包括LCL161、AT-406等；二聚體抑制劑可激活Caspase-3/7/9的活性，達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的目的，包括APG-1387等。

       目前全球尚無IAP抑制劑獲批上市，IAP不僅可以作為藥物靶標(biāo)，也可以作為E3連接酶設(shè)計(jì)SNIPERs降解靶標(biāo)蛋白（化合物20通過UPS系統(tǒng)招募IAP來降解RIPK2），而且還可以連接其它E3連接酶配體合成異型雙功能降解劑（如異型雙功能泛IAP降解劑9和12）。

       參考資料：

       1.Deveraux, Q.L.; Reed, J.C. IAP family proteins—Suppressors of apoptosis. Genes Dev. 1999, 13, 239–252.

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       4.Seulki Park, Dayoung Kim, Woori Lee, Jin Hwa Cho, Sungyoung Kim, Ga Seul Lee, Jeong Hee Moon, Jung-Ae Kim, Jae Du Ha, Jeong-Hoon Kim, Hyun Jin Kim, Discovery of pan-IAP degraders via a CRBN recruiting mechanism, European Journal of Medicinal Chemistry 245 (2023) 114910.

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       7.Arvind Negi, Kavindra Kumar Kesari, and Anne Sophie Voisin-Chiret, Estrogen Receptor-_ Targeting: PROTACs, SNIPERs, Peptide-PROTACs, Antibody Conjugated PROTACs and SNIPERs, Pharmaceutics 2022, 14, 2523.

       8.A.H. Miah, I.E. Smith, M. Rackham, A. Mares, A.R. Thawani, R. Nagilla, P.A. Haile, B.J. Votta, L.J. Gordon, G. Watt, Optimization of a series of RIPK2 PROTACs, J. Med. Chem. 64 (2021) 12978–13003.

       9.Yuen Lam Dora Ng, Alesa Bricelj, Jacqueline A. Jansen, Arunima Murgai, Kirsten Peter, Katherine A. Donovan, Michael Gutschow, Jan Kronke, Christian Steinebach, and Izidor Sosic, Heterobifunctional Ligase Recruiters Enable pan-Degradation of Inhibitor of Apoptosis Proteins, J Med Chem. 2023 Mar 30.