腫瘤抑制蛋白p53是一種轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞死亡中起著關(guān)鍵作用——P53誘導(dǎo)其自身抑制劑（人類雙微體-2、HDM2）的轉(zhuǎn)錄。
HDM2與p53結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，將p53蛋白引進(jìn)細(xì)胞質(zhì)，并通過E3泛素途徑將其靶向蛋白酶體降解。
HDM2通過三種機(jī)制抑制p53活性：
1）充當(dāng)E3泛素連接酶以促進(jìn)p53降解；
2）結(jié)合并阻斷p53轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域；
3）將p53從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)。
在某些類型的癌癥（骨肉瘤、軟組織、肺癌和腦瘤等）中已經(jīng)觀察到，HDM2的過表達(dá)使P53失活。HDM2-p53蛋白-蛋白相互作用的中斷(PPI)能解除p53的負(fù)調(diào)控，使其發(fā)揮抗增殖和促凋亡功能。因此，使用HDM2?p53 PPI抑制劑已經(jīng)成為治療人癌癥（WT p53）的一種有吸引力的方法。
每一篇JMC中的Drug Annotation都是一個(gè)新藥開發(fā)的小故事，本篇文章想分享一下默克公司的MK4688的改造故事。
兩種蛋白接觸的表面具有l(wèi)arge, flat的疏水界面，使得蛋白蛋白抑制劑與經(jīng)典的口服藥物相比具有分子量更大、更親脂的特點(diǎn)，這類分子特性導(dǎo)致臨床需要高劑量和PK具有可變異性，從而降低了分子最終成藥的可能性。
圖1 幾類不同骨架的HDM2抑制劑及其理化性質(zhì)、活性和臨床進(jìn)展
HDM2與p53的相互作用主要是通過疏水界面介導(dǎo)的，其中位于p53的N端α螺旋上的Phe19、Trp23和Leu26殘基與HDM2蛋白表面的疏水口袋產(chǎn)生相互作用。
盡管PPI界面具有這一特點(diǎn)，仍有一些HDM2抑制劑進(jìn)入了臨床開發(fā)中，圖1這些抑制劑都具有一些特點(diǎn)：高親脂性（Clogp較大）、高分子量(MW)、需要高劑量才能達(dá)到臨床需要的有效性。
在一期臨床中的AML(急性髓系白血病)試驗(yàn)，RG7112顯示了可變異性的暴露，在MTD劑量(1500 mg，BID)下，只有37%的患者達(dá)到了實(shí)現(xiàn)有效性所需要的最小暴露量。因此，提高HDM2抑制劑的類藥性非常重要。
第二代的RG7388, SAR405838, AMG232完善了分子的理化性質(zhì)，目前處于臨床研究階段。MK-8242分子具有高M(jìn)W，高clogp，較高的推薦劑量（2期劑量為每天0.8 g）；默克公司最初通過高通量篩選新的骨架分子以期望得到分子量低、劑量也低的HDM2-P53抑制劑。
圖2 hit的優(yōu)化過程及2和HDM2蛋白的共晶 (PDB 7NA1)
通過高通量篩選得到化合物1，這是一個(gè)分子量低、帶嘌呤骨架的小分子化合物，對(duì)hit的優(yōu)化集中在嘌呤母核的C6、N7和C8上，環(huán)己亞甲基替換為對(duì)氯芐基、間苯基改為苯并噻吩、NH的α位碳引入手性甲基；最終活性提高了30倍，并提高了LBE（配體結(jié)合效率）；通過觀察化合物2和HDM2蛋白的X-ray晶體結(jié)構(gòu)，2的嘌呤骨架具有α螺旋的特征，高效的將取代基伸入3個(gè)已報(bào)道過的HDM2蛋白表面的hot spot結(jié)合口袋中，C6烷基胺占據(jù)Leu26口袋，N7的芐基填充Trp23口袋，C8苯并噻吩占據(jù)了Phe19口袋。C2羧酸與HDM2的His96側(cè)鏈發(fā)生關(guān)鍵的靜電相互作用，類似于AMG232的羧酸取代基的作用。
默克公司的優(yōu)化策略是在盡量不增加分子量的基礎(chǔ)上提高活性、提高成藥性。
圖3 取代基團(tuán)優(yōu)化過程
根據(jù)圖2的共晶，羧酸位于His96口袋、苯并噻唑在Phe19口袋、氯苯在Trp23口袋、環(huán)丙甲基在Leu26口袋；從圖3看出，先導(dǎo)2中的環(huán)丙基改為環(huán)丁基、氯芐基改為三氟甲基芐基提高了與leu26和Trp23的疏水接觸，觀察Phe19口袋的空腔可以減小取代基團(tuán)的大小，得到的化合物23，活性提高了17倍；最終把紅色片段優(yōu)化到苯環(huán)手性取代的嗎啉環(huán)得到化合物27，活性達(dá)到1.8 nM;根據(jù)NMR-based模型，藍(lán)色區(qū)域的Trp23口袋更適合飽和脂肪環(huán)占據(jù)，且引入了手性發(fā)現(xiàn)化合物33，活性達(dá)到2.2 nM，把27和33的最優(yōu)取代片段整合到一塊得到了化合物15，活性達(dá)到0.2 nM.
圖4 C2位羧酸的生物電子等排改造
在取得了優(yōu)異的TR-FRET的 IC50活性后，化合物15的細(xì)胞活性BLA IC50只有1.1μmoL，降低了5500倍，這種情況很可能是因?yàn)猷堰属人岵糠郑ㄓ?jì)算pKa為2.1）的高酸度導(dǎo)致被動(dòng)滲透性差，由于C2羧酸與HDM2的His96側(cè)鏈發(fā)生了關(guān)鍵的氫鍵作用，默克公司做了羧酸的生物電子等排來改造結(jié)構(gòu)。最終得到圖4中的化合物16，細(xì)胞活性進(jìn)入百納以內(nèi)。但是化合物16在大鼠中的清除率高達(dá)73 mL/min/kg，生物利用度也只有2%，仍需接著改。默克研發(fā)人員認(rèn)為，高的親脂性導(dǎo)致了脫靶和較差的PK，他們后續(xù)采取了一種策略，專注于降低總體log D和提高分子的LLE。
圖5 C6位的構(gòu)效關(guān)系
從圖5可以看出，嘌呤骨架中的X改為C，可以降低分子的酸性，提高PKa，此外，基于嘌呤衍生化合物的NMR-based模型，嘌呤N3和N9都位于HDM2表面的疏水區(qū)域，改成碳原子也有利于疏水結(jié)合；最終間氯吡啶環(huán)的引入得到了化合物42，與16相比，LLE由5.93提高至6.53，LogD由3.27降低至2.69. 但是化合物42的PK仍然有缺陷。
圖6 咪唑嘧啶骨架上對(duì)PK優(yōu)化
對(duì)PK繼續(xù)優(yōu)化，42的MRT在兩種種屬中都很短(在大鼠和狗中分別為0.4和1.7 h)，這表明需要優(yōu)化來實(shí)現(xiàn)低劑量給藥，MetID對(duì)42的研究指出親脂取代的嗎 啡啉和環(huán)己基甲基是易代謝位點(diǎn)。因而把甲基去掉，同時(shí)封閉嗎啉環(huán)上的易代謝位點(diǎn)，得到了化合物56，在犬和大鼠中的PK均比較優(yōu)秀。
圖7 大鼠、狗和恒河猴的臨床前PKs
最后，詳細(xì)的在大鼠、犬和恒河猴體內(nèi)進(jìn)行了單次靜脈或口服給藥后的PK研究?；衔?6在體外和體內(nèi)清除存在物種差異，其中犬清除低，猴和大鼠清除中等；此外56在犬中有很好的口服生物利用度，在大鼠中具有中等的生物利用度，這可能是由于肝 臟首過效應(yīng)的差異。盡管存在這些差異，但在不同物種間觀察到很強(qiáng)的體外/體內(nèi)相關(guān)性，支持了一個(gè)可靠的人體內(nèi)PK預(yù)測(cè)。根據(jù)默克的第一代HDM2抑制劑MK-8242的臨床經(jīng)驗(yàn)，設(shè)定了25 μM h的人的目標(biāo)暴露量（AUC）。將這些分析與預(yù)測(cè)的人藥代動(dòng)力學(xué)相結(jié)合，預(yù)測(cè)56給藥下人的劑量為75 mg QD (38 mg BID)。與MK-8242達(dá)到相同暴露水平所需的劑量相比，以及與其他第一代HDM2抑制劑療效所需的劑量相比，這一低劑量代表了顯著的改善?；衔?6也被稱為MK-4688，目前仍在臨床前繼續(xù)進(jìn)行安全性研究。
參考文獻(xiàn)：
1，B. Wesley Trotter et al; Discovery of MK-4688: an Efficient Inhibitor of the HDM2?p53
Protein?Protein Interaction, doi.org/10.1021/acs.jmedchem.1c01524。
2，諾華股份有限公司；MDM2抑制劑的延長的低劑量方案；WO2020/128892。
3，網(wǎng)站：https://clinicaltrials.gov/ct2/home。
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