淺析新一代人源化動(dòng)物模型及其在臨床轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

       導(dǎo)語

       隨著生物醫(yī)藥特別是免疫治療的發(fā)展，人源化小鼠得到廣泛的應(yīng)用。人源化小鼠分為轉(zhuǎn)基因人源化小鼠和免疫系統(tǒng)人源化小鼠。轉(zhuǎn)基因人源化小鼠使用方便、重復(fù)性好，得到廣泛的應(yīng)用。利用該模型也確有有很多藥物進(jìn)入了臨床。但是在使用過程中，業(yè)內(nèi)逐漸發(fā)現(xiàn)該體系有以下缺陷：

       • 1. 由于人源化策略不一樣或者小鼠遺傳背景不一樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)有差距。

       • 2.人源抗體會(huì)在免疫健全小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗藥抗體（anti-drug antibody, ADA）反應(yīng)，不適于長(zhǎng)時(shí)間觀察抗體藥物治療效果。

       • 3.負(fù)責(zé)藥物半衰期的FcRN分子，Albumin分子有種屬差異性。而半衰期又決定了藥物的療效和免疫藥物不良反應(yīng)（irAE）。

       • 4.負(fù)責(zé)抗體依賴的細(xì)胞免疫效應(yīng)的FcgR分子，有種屬差異性?？贵w分子的活性化Fc受體（CD16a、CD32a、CD64）和抑制性Fc受體（CD32b）的共同影響。而抗體依賴的細(xì)胞活性又跟抗體與抗原的親和性，腫瘤表面抗原的密度相關(guān)。

       • 5.對(duì)于研究靶向腫瘤相關(guān)抗原（TAA）的ADC藥物和多特異抗體藥物，需要建立表達(dá)人TAA的CDX模型。但是小鼠對(duì)TAA沒有建立其免疫耐受，TAA容易在體內(nèi)產(chǎn)生免疫原性。表達(dá)TAA的細(xì)胞系很容易被體內(nèi)免疫系統(tǒng)清除。

       • 6.TAA在細(xì)胞的表達(dá)水平和臨床有差異，TAA在細(xì)胞上的表達(dá)密度和抗體藥物與抗原的親和性影響了抗原藥物在臨床上的表現(xiàn)。

       • 7.體內(nèi)荷瘤使用的是鼠源細(xì)胞系，缺少PDX模型的異質(zhì)性和臨床相關(guān)性。

       • 8.對(duì)于復(fù)雜的免疫治療會(huì)涉及到多個(gè)基因都人源化（如IL12及其受體），因此動(dòng)物模型開發(fā)周期很長(zhǎng)。

       • 9.已有的轉(zhuǎn)基因人源化小鼠針對(duì)的靶標(biāo)賽道擁擠，對(duì)于新靶點(diǎn)有嚴(yán)重的滯后效應(yīng)。

       • 10.應(yīng)用多局限于抗體類研究，對(duì)于細(xì)胞治療、治療性疫苗及其綜合免疫治療（如腫瘤治療性疫苗聯(lián)合PD1抗體，免疫治療聯(lián)合細(xì)胞因子）缺少完 美解決方案。

       因此，野生型小鼠和人源化轉(zhuǎn)基因小鼠多用于前體藥物概念性的驗(yàn)證。在進(jìn)入臨床之前，有必要利用免疫系統(tǒng)人源化動(dòng)物模型再加以驗(yàn)證。對(duì)于嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乃幬镩_發(fā)流程，這兩種人源化模型可以交互驗(yàn)證。對(duì)于免疫系統(tǒng)人源化動(dòng)物模型國(guó)內(nèi)的應(yīng)用尚不如國(guó)外普遍。下面筆者從介紹免疫系統(tǒng)人源小鼠模型的應(yīng)用、局限和發(fā)展等方面加以介紹。

       攜帶SCID突變，IL2Rγ基因失活的NOD小鼠缺少內(nèi)源性的T、B、NK細(xì)胞，并且天然免疫細(xì)胞的活性也比較低。因此該重度免疫缺陷小鼠模型適合在體內(nèi)移植各種人腫瘤細(xì)胞和重建人源免疫系統(tǒng)。由于人和小鼠免疫系統(tǒng)的差異以及發(fā)展各種免疫治療相關(guān)技術(shù)（檢驗(yàn)點(diǎn)抗體、雙特異抗體、CAR-T、mRNA疫苗、溶瘤病毒等）發(fā)展的需要，同時(shí)生長(zhǎng)人免疫系統(tǒng)和人腫瘤組織的雙人源化PDX小鼠逐漸成為開發(fā)和驗(yàn)證各種腫瘤免疫藥物必不可少的工具，如圖1可見人源化小鼠的構(gòu)成及其應(yīng)用。

圖1. 雙人源化小鼠的構(gòu)成及其應(yīng)用

       PART.01

       小鼠重建人免疫系統(tǒng)的方法

       通過重度免疫缺陷小鼠重建人的免疫系統(tǒng)大概有以下三種方法：

       01  hPBMC小鼠

       移植了人外周血單核白細(xì)胞的hPBMC小鼠，主要用于靶向人T細(xì)胞藥物的研究。

       02  HSC小鼠

       移植了CD34+HSC細(xì)胞的人源化小鼠，即HSC小鼠。HSC細(xì)胞可以在體內(nèi)分化出人T細(xì)胞、B細(xì)胞及少量髓系細(xì)胞。

       03  BLT小鼠

       將人胎胸腺組織植入NSG小鼠的腎包膜下，同時(shí)從靜脈注射自體胎肝的造血干細(xì)胞。該小鼠模型的優(yōu)點(diǎn)是T細(xì)胞的發(fā)育經(jīng)過源于自體胸腺組織的HLA的選擇性成熟。目前，該模型主要被用于實(shí)驗(yàn)室艾滋病的研究。由于該模型需要的組織和細(xì)胞源自流產(chǎn)胎兒，因此，該模型不可能得到大規(guī)模的商用。

       目前，hPBMC小鼠和HSC小鼠被廣泛用于治療藥物的臨床前轉(zhuǎn)化。

       hPBMC小鼠的特點(diǎn)、改進(jìn)及其應(yīng)用

       移植了hPBMC的小鼠主要在體內(nèi)重建了人T細(xì)胞，因此該小鼠模型主要用于靶向T細(xì)胞的藥物。該模型的優(yōu)點(diǎn)是使用簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜，但缺點(diǎn)主要是：

       會(huì)在六周后出現(xiàn)移植物抗宿主病（GvHD）引起的死亡；

       在體內(nèi)重建的免疫細(xì)胞類型單一，沒有NK細(xì)胞和其他髓系細(xì)胞。

       這些特點(diǎn)影響了該小鼠模型的實(shí)驗(yàn)窗口和應(yīng)用范圍。hPBMC小鼠GvHD疾病的程度既跟不同供體來源的PBMC相關(guān)，也跟小鼠品系相關(guān)。國(guó)內(nèi)有很多商品化重度免疫缺陷型小鼠（NOD SCID/IL2Rγ^-/-）。有些品牌的免疫缺陷小鼠，人T細(xì)胞重建速度較快，但是GvHD出現(xiàn)得比較早。通過敲除小鼠的MHC分子，可以大大延遲GvHD出現(xiàn)的時(shí)間，但是T細(xì)胞重建的效率也會(huì)受到影響。在MHC缺陷的NOD SCID/IL2Rγ^-/-表達(dá)T細(xì)胞的生長(zhǎng)因子也許是一個(gè)比較好的方向。hPBMC小鼠的B細(xì)胞和髓系細(xì)胞比較少也是其主要缺陷之一，而且不能通過過表達(dá)一些人細(xì)胞因子得到改善。有些基因改造的免疫缺陷小鼠，如表達(dá)了人IL15的NVG-IL15小鼠，在移植了人PBMC后，可觀察到一定比例的人NK細(xì)胞和T細(xì)胞的重建。但是，在人PBMC NVG-IL15小鼠中NK細(xì)胞的功能有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，根據(jù)檢測(cè)hPBMC小鼠的Treg細(xì)胞含量也比較少，因此該模型有待進(jìn)一步完善。

       hPBMC的小鼠主要應(yīng)用于測(cè)試靶向T細(xì)胞的免疫類藥物，如免疫檢驗(yàn)點(diǎn)抗體和靶向CD3的雙特異抗體的體內(nèi)藥效測(cè)試。另外，hPBMC小鼠也可用于治療GvHD疾病相關(guān)免疫類藥物的開發(fā)和樹突狀疫苗的評(píng)估。據(jù)Jackson實(shí)驗(yàn)室報(bào)道，hPBMC小鼠也可以用于測(cè)試各種靶向T細(xì)胞抗體藥物和CAR-T藥物引起的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞因子風(fēng)暴。

       第一代HSC小鼠的缺陷及其應(yīng)用

       移植了人HSC CD34+細(xì)胞的重度免疫缺陷小鼠可在體內(nèi)重建出人免疫系統(tǒng)。由于部分鼠源細(xì)胞因子跟人源細(xì)胞因子不存在交叉反應(yīng)，因此在第一代的NOD SCID/IL2RγKO小鼠重建的人免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全，主要以人B細(xì)胞（50%-80%）和人T細(xì)胞（10%-30%）為主，但髓系細(xì)胞（2%-5%）、NK細(xì)胞（<1%）和樹突細(xì)胞（<1%）比例較少。第一代HSC小鼠的優(yōu)點(diǎn)是沒有GvHD疾病，壽命可達(dá)到一年。因此，其應(yīng)用主要是長(zhǎng)效研究靶向T細(xì)胞的抗體藥物，如雙特異型抗體和免疫檢驗(yàn)點(diǎn)抗體等?，F(xiàn)有的移植了HSC的人源化小鼠只是重建了部分免疫系統(tǒng)，不能真實(shí)地模擬腫瘤的免疫微環(huán)境，無法預(yù)測(cè)免疫藥物在臨床上的反應(yīng)和治療效果。顯然不能適應(yīng)后PD1時(shí)代，創(chuàng)新藥物研發(fā)的需求。

       PART.02

       若干第二代免疫系統(tǒng)

       人源化小鼠

       通過基因修飾，使得NOD SCID/IL2Rγ^-/-小鼠過表達(dá)不同人的細(xì)胞因子（如NSG SGM3小鼠、NOG EXL小鼠和NOG IL15小鼠）可以提高免疫系統(tǒng)重建效率，增加髓系細(xì)胞、NK細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞的重建比例。由于這些動(dòng)物模型表達(dá)不同的細(xì)胞因子，有不同的表達(dá)量，導(dǎo)致在這些小鼠重建的人免疫系統(tǒng)有不同的特點(diǎn)，下面將介紹一下已開發(fā)的二代免疫系統(tǒng)人源化小鼠及其特點(diǎn)。

       系列髓系增強(qiáng)型人源化小鼠

       MISTRG小鼠是在Rag2^−/−IL2RＹ^−/−(BRG）小鼠遺傳背景上利用內(nèi)源性啟動(dòng)子生理性表達(dá)人GM-CSF、IL-3、M-CSF和TPO，以促進(jìn)人先天免疫系統(tǒng)的重建。隨后，將MITRG小鼠的SIRPα基因人源化，從而產(chǎn)生MISTRG小鼠。在該小鼠模型內(nèi)重建的人髓系細(xì)胞的比例是一代重度免疫缺陷小鼠的3到5倍，可以發(fā)育出人類單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、常規(guī)和漿細(xì)胞樣DCs的功能群體。然而，在該小鼠完成人免疫系統(tǒng)重建后，小鼠紅細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的缺損且與人類CD45細(xì)胞重建水平密切相關(guān)，這導(dǎo)致在健康小鼠身上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的時(shí)間縮短到幾周時(shí)間。此外，MISTRG小鼠對(duì)飼養(yǎng)條件比較高，否則繁殖效率比較低（筆者使用經(jīng)驗(yàn)總結(jié)），且尚沒有進(jìn)入商業(yè)化。

       NSG™-SGM3小鼠是Jackson Lab開發(fā)的，利用CMV啟動(dòng)子表達(dá)不同的人類細(xì)胞因子、GM-CSF、IL-3和SCF。因此，其表達(dá)超生理水平的細(xì)胞因子（2000-4000 pg/ml）。該小鼠模型突出特點(diǎn)是在移植臍帶血（UCB）CD34+細(xì)胞后，人源免疫系統(tǒng)重建速度比較快，T細(xì)胞出現(xiàn)得比較早，髓系細(xì)胞比例高。另外，在該人源化小鼠體內(nèi)還發(fā)現(xiàn)相當(dāng)比例的Treg細(xì)胞和肥大細(xì)胞（Mast Cell）。NSG™-SGM3小鼠的主要缺點(diǎn)仍表現(xiàn)為貧血癥。此外，還伴有骨髓衰竭和嚴(yán)重的致命性巨噬細(xì)胞活化綜合征（MAS），并呈現(xiàn)人類IL-6分泌升高的證據(jù)。據(jù)記載，在移植CD34+細(xì)胞后的第10 到20周之間，小鼠死亡率累積上升。這使得NSG™-SGM3小鼠用于免疫腫瘤學(xué)研究具有挑戰(zhàn)性。NSG™-SGM3小鼠的應(yīng)用主要是檢測(cè)CAR-T引起的細(xì)胞因子風(fēng)暴，另外，支持CAR-Mac細(xì)胞在體內(nèi)的重建。

       NOG™-EXL小鼠是日本CIEA在NOG背景上，利用SV40啟動(dòng)子過表達(dá)人GM-CSF 和IL-3。細(xì)胞因子表達(dá)水平更加柔和，在35到80pg/ml的范圍內(nèi)。huNOG-EXL小鼠也可以成功移植更多的人髓系細(xì)胞，但是壽命較人源化的NSG™-SGM3小鼠長(zhǎng)。NOG-EXL在CD34細(xì)胞移植16周以后會(huì)出現(xiàn)炸毛和體重減輕現(xiàn)象，20周以后會(huì)逐漸出現(xiàn)死亡。因此，CIEA建議實(shí)驗(yàn)在第18周以前完成。另外，該小鼠有被檢測(cè)到樹突狀細(xì)胞發(fā)育，但是Treg細(xì)胞還是比較少。因此，該小鼠有待被進(jìn)一步優(yōu)化。該小鼠曾被用于驗(yàn)證PD1抗體的抗腫瘤效應(yīng)，也支持急性髓系白細(xì)胞（AML）PDX模型的藥效驗(yàn)證。

       以上髓系增強(qiáng)型小鼠被用于治療性抗體的研究，其特點(diǎn)是天然免疫細(xì)胞類型更加豐富，有利于模擬免疫藥物對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)控，如可以檢測(cè)到M2-Macrophage、樹突狀細(xì)胞。另外，實(shí)驗(yàn)窗口也比PBMC小鼠略長(zhǎng)。主要缺點(diǎn)是普遍出現(xiàn)貧血癥，壽命仍較人源化NSG小鼠短，而且沒有NK細(xì)胞的發(fā)育。

       人類NK細(xì)胞及動(dòng)物模型

       NK細(xì)胞是免疫腫瘤學(xué)研究的一個(gè)有吸引力的靶點(diǎn)。然而，在大多數(shù)人源化小鼠模型中，人類NK細(xì)胞的發(fā)育和存活受到限制。IL-15是NK細(xì)胞群發(fā)育、存活和功能的關(guān)鍵細(xì)胞因子。在重度免疫缺陷小鼠過表達(dá)IL15或者將IL15人源化，有利于人NK細(xì)胞的發(fā)育和體內(nèi)增殖。由于基因修飾方法的不同，導(dǎo)致人IL15在不同的小鼠體內(nèi)有不同的表達(dá)量。一般來說，IL15血清濃度在100pg/ml以下，有利于CD34細(xì)胞在體內(nèi)的重建，GvHD疾病不是很嚴(yán)重。而100pg/ml以上則有利于外周血NK在體內(nèi)的增殖。值得注意的是，過高的IL15體內(nèi)環(huán)境可能會(huì)導(dǎo)致NK細(xì)胞的耗竭，不利于長(zhǎng)期研究NK的抗腫瘤功能。IL15小鼠的主要應(yīng)用場(chǎng)景是測(cè)試抗體的ADCC藥效和靶向NK的雙特異抗體，其在CAR-NK藥效方面的應(yīng)用仍處于探索階段。

       hIL2-NOG小鼠

       hIL2-NOG小鼠是CIEA開發(fā)的在NOG小鼠過表達(dá)人IL2。因?yàn)楦咚降腎L2可以放大T細(xì)胞的毒殺作用，因此該模型被認(rèn)為可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)PD1療法和TILs療法在臨床的藥效。此外，該動(dòng)物模型也被證明可以有效地預(yù)測(cè)TCR-T和CAR-T對(duì)實(shí)體瘤的抑制作用，而且抗腫瘤效果和IL2的表達(dá)量正相關(guān)。不過，hIL2-NOG小鼠的主要缺陷是IL2表達(dá)水平在不同小鼠間差異比較大。每只小鼠的IL2表達(dá)量需要單獨(dú)測(cè)定，這可能和CIEA使用CMV啟動(dòng)子和隨機(jī)插入的轉(zhuǎn)基因策略相關(guān)。

       IL-6人源化動(dòng)物模型

       耶魯大學(xué)的Flavell教授實(shí)驗(yàn)室將BRGS小鼠的IL6基因人源化，得到BRGS6小鼠。HSC人源化后的BRGS小鼠被卵清蛋白免疫后可產(chǎn)生針對(duì)該蛋白的人IgGs。CIEA開發(fā)的hIL6-NOG小鼠在被CD34+HSC細(xì)胞移植后，能夠有效地重建人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，而且髓系細(xì)胞中有相當(dāng)一部分是HLA-DR低表達(dá)的髓系細(xì)胞，預(yù)示著該模型可能有助于模擬腫瘤免疫抑制微環(huán)境。Jackson實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的NSG IL6小鼠被證明與慢性GvHD疾病發(fā)生相關(guān)。IL-6人源化的動(dòng)物模型更多用處可能是支持多發(fā)性骨髓瘤在體內(nèi)重建，為多發(fā)性骨髓瘤的治療提供疾病模型。需要指出的是，人IL6可能和小鼠IL6受體存在交叉反應(yīng)。不同的人源化策略可能導(dǎo)致不同的IL6表達(dá)量，過高的IL6水平不利于小鼠的健康。

       人源化FLT3L的模型

       FLT3配體（FLT3L）在包括DCs在內(nèi)的幾種髓系細(xì)胞群的發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。但是人FLT3L可能和鼠源FLT3存在交叉反應(yīng)，能激活鼠源天然免疫細(xì)胞。因此，向FLT3缺陷的CD34+HSC移植SCID小鼠注射重組人FLT3L細(xì)胞因子或編碼FLT3LG的腺病毒可增加中單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和常規(guī)漿細(xì)胞樣DCs和CD56+NK細(xì)胞的數(shù)量。另有研究表明，將人FLT3L注射到CD34+HSPC植入的NSG-SGM3小鼠中改善了人CD141+DCs的發(fā)育，并增強(qiáng)了抗PD-1抗體（單獨(dú)或與TLR3激動(dòng)劑一起）的活性，可以抑制黑色素瘤CDXs的生長(zhǎng)。FLT3L還被用于生物疫苗研究，注射了FLT3L的FLT3缺陷型NSG HLA A2小鼠可以產(chǎn)生較強(qiáng)的抗原特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)。

       淋巴結(jié)的發(fā)育

       將免疫系統(tǒng)人源化小鼠應(yīng)用于生物疫苗的研究，存在的另一個(gè)局限是重度免疫缺陷小鼠沒有正常的淋巴結(jié)發(fā)育。重度免疫缺陷小鼠一般有IL2Rγ基因缺陷，該基因也是IL7的受體組成之一。IL-7信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于整個(gè)淋巴系統(tǒng)發(fā)育和維持至關(guān)重要，IL7信號(hào)通路的缺陷可導(dǎo)致重度免疫缺陷小鼠淋巴結(jié)發(fā)育障礙。補(bǔ)救方法之一是在缺陷小鼠體內(nèi)過表達(dá)TLSP基因。TSLP可以代償和IL-7信號(hào)功能的缺失，但是它的受體不需要IL2Rγ基因。過表達(dá)鼠源TSLP基因，有助于在免疫缺陷小鼠發(fā)育淋巴結(jié)。解決淋巴結(jié)發(fā)育的另一個(gè)方案是在淋巴組織誘導(dǎo)細(xì)胞（LTi）特異性的表達(dá)IL2Rγ基因。有淋巴結(jié)和樹突狀細(xì)胞的NSG HLA A2小鼠將是腫瘤疫苗研究有利的工具。利用免疫系統(tǒng)人源化小鼠產(chǎn)生高質(zhì)量的抗原特異性的抗體，一直是學(xué)術(shù)界和企業(yè)界急迫需要解決的問題之一，擁有淋巴結(jié)和B細(xì)胞發(fā)生中心是其先提條件。

PART.03

淺析未來發(fā)展方向

       首先，持續(xù)完善人源化免疫系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)人源化小鼠對(duì)于預(yù)測(cè)免疫類藥物在臨床上的反應(yīng)和療效，無疑是十分重要的。盡管越來越多的第二代免疫系統(tǒng)人源化小鼠有助于逐步完善人源化免疫系統(tǒng)，但是，沒有一只人源化小鼠能概括TME內(nèi)免疫環(huán)境的各個(gè)方面。例如，除了T、B和髓系細(xì)胞，在腫瘤免疫微環(huán)境中還應(yīng)存在Treg細(xì)胞、髓系抑制性細(xì)胞（MDSC）、肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。因此，針對(duì)不同的免疫類藥物應(yīng)該定制不同的個(gè)性化免疫系統(tǒng)人源化小鼠加以研究。另外，針對(duì)髓系增強(qiáng)型小鼠壽命普遍減少的現(xiàn)象，可以采取瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞因子的策略，避免免疫細(xì)胞的過度激活。此外，將小鼠的CD47基因人源化，也有望減少貧血癥在人源化小鼠中的發(fā)生幾率。

圖2. 完全免疫系統(tǒng)人源化模型建議的基因修飾

       其次，建立抗原特異性免疫反應(yīng)。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)方法依賴于不匹配的腫瘤和免疫系統(tǒng)的使用。這些異體移植物腫瘤模型已成功用于浸潤(rùn)TME的人類免疫細(xì)胞，并研究免疫系統(tǒng)與腫瘤的相互作用。此外，由于HLA不匹配和缺乏支持T細(xì)胞發(fā)育的人類胸腺上皮，HLA限制腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的生成具有挑戰(zhàn)性。利用腫瘤病人的骨髓細(xì)胞或者G-CSF活化的外周血白細(xì)胞，在小鼠重建和腫瘤同源的個(gè)性化免疫系統(tǒng)在技術(shù)上也完全可以實(shí)現(xiàn)。移植自體的胸腺上皮細(xì)胞，有助于在小鼠體內(nèi)完成自體HLA依賴的人T細(xì)胞的分化和成熟。利用病人的iPS細(xì)胞，在體外分化胸腺上皮細(xì)胞可替代從病人的胸腺組織用于免疫系統(tǒng)T細(xì)胞的成熟。利用iPS分化的CD34細(xì)胞也將有助于建立個(gè)性化的免疫系統(tǒng)人源化小鼠。這也是今后值得探索的方向。

       完善免疫系統(tǒng)人源化小鼠的關(guān)鍵是增強(qiáng)其在臨床轉(zhuǎn)化和藥物評(píng)估中的應(yīng)用。利用人源化小鼠評(píng)估抗體類藥物是其主要應(yīng)用場(chǎng)景之一，但是由于免疫缺陷小鼠的體內(nèi)沒有B細(xì)胞和抗體，導(dǎo)致小鼠髓系細(xì)胞上表達(dá)的FcγR非特異性地捕捉人源化抗體。這不僅縮短了治療性抗體的半衰期，還非特異性地激活了鼠源的ADCP反應(yīng)。鼠源的ADCP效應(yīng)不僅可以抑制腫瘤，增加了藥物評(píng)估的假陽性，而且還降低外周血人T細(xì)胞的數(shù)量產(chǎn)生假陰性。FcγR細(xì)胞的存在將影響抗體評(píng)估結(jié)果的準(zhǔn)確性，而且實(shí)驗(yàn)差異性比較大。敲除鼠源的FcγR有助于完善抗體藥物的臨床前評(píng)估。

       細(xì)胞治療是免疫系統(tǒng)人源化小鼠的另一個(gè)重要應(yīng)用場(chǎng)景。在這方面的主要問題是很多免疫細(xì)胞的體外培養(yǎng)依賴細(xì)胞因子，但是免疫缺陷小鼠體內(nèi)沒有提供同樣的細(xì)胞因子環(huán)境，這導(dǎo)致某些治療免疫細(xì)胞，如CAR-NK、UCAR-T、CAR-Mac、CAR-NKT等，在小鼠體內(nèi)的半衰期比較短，需要不斷地注射免疫細(xì)胞才能觀察到對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。不同的免疫細(xì)胞需要小鼠提供不同的細(xì)胞因子生長(zhǎng)環(huán)境。另外，針對(duì)治療實(shí)體瘤細(xì)胞，有些免疫細(xì)胞（如TILs、TCR-T）等往往需要依賴高濃度的IL2才能觀測(cè)到結(jié)果。這不是說在臨床上一定需要高濃度IL2細(xì)胞因子才能治療，而是沒有這些細(xì)胞因子，在臨床前的動(dòng)物模型上，很難短時(shí)間觀察到臨床上的效應(yīng)。此外，某些髓系PDX模型也需要體內(nèi)提供細(xì)胞因子，如急性髓系白血?。ˋML）PDX模型依賴人GMCSF，而多發(fā)性骨髓瘤(MM)的PDX模型需要人IL6。相較于實(shí)體瘤，細(xì)胞治療在液體瘤上的效果更好。開展針對(duì)髓系細(xì)胞瘤的細(xì)胞治療的開發(fā)，可以避免B細(xì)胞瘤賽道過于擁擠。建立髓系細(xì)胞瘤的PDX模型是開展相關(guān)工作的先提條件。

       隨著世界疫情的過去，mRNA疫苗的研究重點(diǎn)會(huì)逐漸向腫瘤疫苗傾斜。但是現(xiàn)有的動(dòng)物模型不能有效地評(píng)估腫瘤疫苗。首先，野生型小鼠對(duì)人腫瘤相關(guān)抗原沒有建立起免疫耐受，有時(shí)很難有效地建立表達(dá)人抗原的CDX模型。其次，腫瘤疫苗在小鼠體內(nèi)激起MHC限制性的T細(xì)胞反應(yīng)。小鼠MHC限制性的T細(xì)胞反應(yīng)并不能用于衡量抗原和疫苗在人體內(nèi)的治療效果。如果腫瘤相關(guān)抗原有細(xì)胞表面部分表達(dá)還會(huì)產(chǎn)生體液免疫。而在臨床上，腫瘤疫苗的療效通常是依賴HLA限制性的T細(xì)胞免疫。因此，業(yè)內(nèi)急需一種由人的抗原呈遞細(xì)胞呈遞的只引起HLA限制性T細(xì)胞免疫反應(yīng)的人源化小鼠模型，用于腫瘤疫苗的評(píng)估。

       最后，可能是免疫治療精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)方向。隨著十多年腫瘤免疫藥物的發(fā)展，一個(gè)業(yè)內(nèi)共識(shí)就是同樣的免疫藥物對(duì)不同的人有不同的療效和不同的毒副作用。例如，同樣選擇腫瘤PD-L1高表達(dá)的人群，PD1抗體的臨床有效性只有30%左右。有些病人對(duì)于CAR-T細(xì)胞治療表現(xiàn)出嚴(yán)重的毒副反應(yīng)和細(xì)胞因子風(fēng)暴，特別嚴(yán)重情況下會(huì)出現(xiàn)死亡。臨床實(shí)驗(yàn)階段出現(xiàn)死亡事件將大大延緩治療藥物的審批速度。如何利用人源化小鼠在短時(shí)間內(nèi)預(yù)測(cè)病人對(duì)不同免疫藥物的響應(yīng)性和細(xì)胞毒 性反應(yīng)，將成為以后應(yīng)用的重點(diǎn)。利用人源化小鼠挑選對(duì)免疫藥物敏感且安全的病人，是臨床藥物臨床前評(píng)估和隨后臨床治療必不可少的手段，未來這方面的市場(chǎng)將十分廣闊。

       結(jié)      語

       總之，同轉(zhuǎn)基因人源化小鼠一樣，免疫系統(tǒng)人源化動(dòng)物模型在創(chuàng)新藥物開發(fā)和臨床精準(zhǔn)治療等方面也十分重要和必要。隨著生物醫(yī)藥的發(fā)展和創(chuàng)新，更多人源化動(dòng)物模型的開發(fā)及其應(yīng)用也需要不斷的完善。這需要國(guó)內(nèi)政府、科研機(jī)構(gòu)、資本和醫(yī)藥公司等多平臺(tái)的共同努力。

       ●關(guān)于未來模式●

       未來模式蘇州生物科技成立于2021年，是由海外團(tuán)隊(duì)與蘇州本地的科學(xué)家聯(lián)合發(fā)起的生物醫(yī)藥服務(wù)外包企業(yè)。同年底，未來模式創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)入選蘇州工業(yè)園區(qū)領(lǐng)軍人才政策。公司將致力于為醫(yī)藥企業(yè)、臨床醫(yī)院和科研用戶提供各種體內(nèi)生物醫(yī)藥開發(fā)和評(píng)估的工具，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)項(xiàng)目提供解決方案。目前，未來模式已經(jīng)開發(fā)了幾十種第二代免疫系統(tǒng)人源化動(dòng)物模型。正在進(jìn)行功能測(cè)試，部分產(chǎn)品如表1。

       表1. 未來模式開發(fā)的部分人源化動(dòng)物模型

       未來模式蘇州生物科技有限公司開發(fā)了長(zhǎng)效的細(xì)胞因子遞送技術(shù)，可以在NV-NSG小鼠長(zhǎng)效表達(dá)多種人細(xì)胞因子，如 IL3、GM-CSF和IL15，因此進(jìn)行HSC重建免疫系統(tǒng)之后，除了常見的人T和B細(xì)胞，還同時(shí)大幅提高了NK細(xì)胞、髓系細(xì)胞的比例。NV-NSG Plus3小鼠免疫系統(tǒng)重建過程及其重建結(jié)果見圖3。經(jīng)過詳細(xì)分析，重建的免疫系統(tǒng)里還發(fā)現(xiàn)相當(dāng)比例的髓系來源的抑制性細(xì)胞（MDSC）（因篇幅，數(shù)據(jù)略）。另外，由于采用化學(xué)清髓和外源表達(dá)細(xì)胞因子策略，在免疫系統(tǒng)人源后，小鼠壽命也沒有受到到嚴(yán)重影響。人源化NV-NSG Plus3的生命周期遠(yuǎn)超其他二代免疫系統(tǒng)人源化小鼠，如圖4。擁有完全免疫系統(tǒng)的HSC NV-NSG Plus3小鼠模型適合長(zhǎng)期體內(nèi)綜合評(píng)估和模擬免疫類藥物在臨床上的反應(yīng)和療效。擁有更多細(xì)胞因子的免疫系統(tǒng)人源化小鼠還在開發(fā)之中。并且未來模式還可為不同的客戶定制不同的免疫系統(tǒng)人源化動(dòng)物模型。

       圖3. NV-NSG plus3免疫系統(tǒng)重建過程和重建結(jié)果

       圖4. 人源化NV-NSG Plus3小鼠和其他第二代人源化小鼠的壽命比較

       作者介紹

       黃菁博士

       黃菁博士中科院北京動(dòng)物所博士畢業(yè)，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部博士后，師從童坦軍院士。此后，先后在愛因斯坦醫(yī)學(xué)院，何大一院士領(lǐng)導(dǎo)的洛克菲勒大學(xué)附屬艾倫戴蒙艾滋病研究所，哥倫比亞大學(xué)進(jìn)行免疫學(xué)研究。在Science Translational Medicine等雜志發(fā)表學(xué)術(shù)文章30余篇，其中第一作者10篇，一作單篇最高引用次數(shù)接近200次。

       黃菁博士主要研究方向是免疫類相關(guān)動(dòng)物模型的開發(fā)及其在生物疫苗評(píng)估中應(yīng)用。曾經(jīng)聯(lián)合世界五百強(qiáng)Leidos公司開發(fā)新型免疫佐劑——PD1阻斷短肽，為美國(guó)科技新銳NovaVax評(píng)價(jià)其抗瘧疾疫苗，利用免疫系統(tǒng)人源化小鼠為法國(guó)巴斯德研究所驗(yàn)證其靶向樹突狀細(xì)胞的納米疫苗。

       2019年，黃菁博士在美國(guó)紐約成立Genomab生物科技有限公司。2021年，回國(guó)創(chuàng)業(yè)。在蘇州成立未來模式蘇州有限公司，主要從事各種免疫系統(tǒng)人源化動(dòng)物模型及人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的開發(fā)和應(yīng)用。

       目前，黃菁博士及其創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)正在積極對(duì)接商業(yè)投資機(jī)構(gòu)，尋求科學(xué)和商業(yè)合作伙伴將人源化動(dòng)物模型產(chǎn)業(yè)化。