EGFR降解劑新技術(shù)

       EGFR是一個易突變蛋白，它的異常與很多疾病相關(guān)，靶向EGFR激酶小分子藥物已經(jīng)發(fā)展了4代，1-3代靶向藥已經(jīng)在臨床廣泛應用，而第四代靶向藥正已經(jīng)在進行臨床試驗。

       但是EGFR是一個非常容易突變的蛋白，這些小分子藥物治療很容易引起耐藥性。除了靶向小分子藥物以外，還采取一些其它克服耐藥性的方法，如聯(lián)合用藥，或采用新技術(shù)蛋白降解靶向嵌合體（PROTAC）和溶酶體靶向嵌合體（LYTAC）等。

       PROTAC受到國內(nèi)外企業(yè)界和學術(shù)界的廣發(fā)關(guān)注，據(jù)不完全統(tǒng)計，GSK在研的PROTAC項目有22個，阿斯利康有19個和Arvinas有18個等。

       目前有很多不同類型的EGFR的PROTACs被報道，但大多數(shù)處于臨床前。國內(nèi)方面，在EGFR PROTAC上布局的藥企并不多。海思科自主研發(fā)的口服EGFR-PROTAC HSK40118的臨床試驗申請于今年獲得NMPA受理，成為國內(nèi)首家申報EGFR PROTAC臨床的國內(nèi)藥企。

       國外企業(yè)C4 Therapeutics在EGFR PROTAC布局較為靠前，其針對EGFR L858R突變的降解劑CFT8919已經(jīng)申報臨床。

       EGFR的LYTAC相對于PROTAC來說研究較少，有兩種類型被報道，一種是基于CI-M6Pn，另一種基于tri-GalNAc。

       EGFR的結(jié)構(gòu)與不同治療策略

       EGFR作為一種跨膜蛋白，屬于EGF家族的成員，是一種受體酪氨酸激酶（RTK）。EGFR在人上皮細胞的信號轉(zhuǎn)導途徑中起關(guān)鍵作用，并參與細胞增殖、侵襲、凋亡和血管生成。

       EGFR由28個外顯子和27個內(nèi)含子組成，編碼1186個氨基酸，其糖基化單體具有～170 kDa分子量。

       EGFR的結(jié)構(gòu)包括三個組成部分：細胞外結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和具有多個自磷酸化位點羧基末端尾部）。

       靶向EGFR的治療策略有多種，包括抑制劑，單克隆抗體（mAb），ADC，PROTAC和LYTAC等（圖1）[1]。

       圖1. 靶向EGFR的不同治療策略

       EGFR激酶抑制劑和耐藥性機制

       靶向EGFR激酶小分子藥已經(jīng)發(fā)展了4代，1-3代靶向藥已經(jīng)在臨床廣泛應用，而第四代靶向藥正在進行臨床試驗。

       第一代藥物包括吉非替尼，厄洛替尼和?？颂婺幔坏诙幬锇ò⒎ㄌ婺岷瓦_可替尼；第三代藥物包括奧希替尼，阿美替尼和伏美替尼。使用這些藥物不可避免會產(chǎn)生耐藥性突變，第三代藥物主要的耐藥突變也是C797S，這需要第四代EGFR靶向藥克服，前三代抑制劑都是靶向催化位點，第四代是靶向變構(gòu)位點。在研第四代藥物非常多，不過多數(shù)處于早期研究階段，目前只有兩個藥物發(fā)表了初步的人體試驗數(shù)據(jù)，分別是BLU-945和BBT-176。

       但是EGFR是一個非常容易突變的蛋白，這些小分子藥物治療很容易引起耐藥性。

       EGFR突變，包括外顯子18-25中的點突變、缺失和插入，可將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的平衡從非活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)，導致EGFR和其他HER家族蛋白在沒有配體刺激的情況下過度磷酸化。外顯子19缺失和外顯子21中的錯義突變（L858R）是最常見的位點突變，占到了肺腺癌EGFR體細胞突變的85％以上[2]。

       EGFR的耐藥機制分為EGFR依賴性耐藥機制和EGFR非依賴性耐藥機制。EGFR依賴性耐藥機制即是由EGFR自身的改變而造成的，包括T790M突變，C797X突變，G796R，G796S和G796D溶劑前沿突變，涉及18外顯子的L718Q，G719C/S/A和G724S突變，涉及21外顯子的G834L突變，野生型EGFR基因擴增等[3]。

       圖2. EGFR依賴性耐藥機制

       EGFR非依賴性耐藥機制即除了EGFR外其它通路蛋白或基因的改變而導致的，如MET擴增，HER2擴增，基因融合/染色體重排，KRAS突變，BRAF V600E突變，PIK3CA突變和PTEN丟失，CDK4或CDK6基因，CDKN2A基因的擴增或突變，F(xiàn)GFR，Src激酶等上游基因異常也可驅(qū)動EGFR抑制劑耐藥。

       靶向EGFR的新技術(shù)PROTAC

       開發(fā)的靶向EGFR突變的小分子藥物可能會暫時解決一些耐藥性突變問題，但是EGFR基因是一個易突變基因，這些靶向小分子藥物或早或晚都會引起耐藥性突變。除了靶向小分子藥物以外，還采取一些其它克服耐藥性的方法，如聯(lián)合用藥，采用新技術(shù)蛋白降解靶向嵌合體（PROTAC）和溶酶體靶向嵌合體（LYTAC）等。

       2018年第一個基于VHL配體的EGFR的PROTAC 16被報道（圖3），2020年第一個EGFR的LYTAC被報道，隨著技術(shù)的發(fā)展，越來越多的EGFR的PROTACs被報道，包括基于CRBN配體的PROTAC，基于IAPs的PROTAC 和靶向EGFR/PARP雙靶點PROTAC降解劑等（圖3）。

       圖3. EGFR-PROTACs和LYTACs開發(fā)取得重大突破的時間表

       PROTAC受到國內(nèi)外企業(yè)界和學術(shù)界的廣發(fā)關(guān)注，據(jù)不完全統(tǒng)計，GSK在研的PROTAC項目有22個，阿斯利康有19個和Arvinas有18個等（圖4）。

       圖4. PROTAC領(lǐng)域的關(guān)鍵發(fā)展的條形圖

       2018年，使用第一代和第二代EGFR抑制劑通過不同接頭連接VHL配體開發(fā)了第一批EGFR PROTACs，如化合物16。化合物16能明顯降解EGFRdel19（DC50 = 11.7 nM）和EGFRL858R（DC50 = 22.3 nM）突變蛋白（圖5A）。

       首 款基于CRBN的強效EGFR-PROTAC，MS154（17）和基于VHL的EGFR-PROTACs在2020年初被報道。17的結(jié)合親和力高于在EGFR WT中最有效的基于VHL的PROTAC MS39（18）（圖5B）?；衔?8和17降解的 EGFRdel19的DC50為5 nM和11nM，降解EGFRL858R的DC50分別為3.3 nM和25 nM。

       用不同長度和組成的接頭連接含有吡啶[3，4-d]嘧啶基第四代EGFR-TKI A（19）（IC50 = 7.2 nM在EGFR L858R/T790M/C797S中）和VHL和CRBN配體開發(fā)了一組13個PROTACs?；赩HL-032的 PROTAC （20a）在HCC827細胞中降解EGFRdel19（DC50 = 34.8 nM）比基于來那度胺的PROTAC（20b）（DC50 = 45.2 nM）更有效（圖5C）。

       Zhang等人應用了四種不同的E3連接酶配體和不同接頭設計合成 PROTACs。PROTAC 22（圖5D）在H1975細胞系中以低濃度（DC50 = 5.9 nM）選擇性降解EGFRL858R/T790M，在A431細胞中即使在較高的濃度下也幾乎不降解EGFRWT的濃度（DC50 > 2000 nM）。

       使用不同PEG接頭連接奧希替尼和CRBN配體來那度胺開發(fā)的PROTACs表現(xiàn)出中度的EGFRdel19降解。如化合物 23（圖5E）在PC9細胞系中降解EGFRdel19（DC50 = 0.161 μM），并且在0.3 μM處治療6小時后發(fā)生最大降解。

       圖5. EGFR的PROTACs

       通過用不同長度的PEG和烷基鏈接頭連接EAI001修飾彈頭JBJ-07-149（24）和CRBN配體泊馬度胺合成一系列PROTACs，如化合物25（圖6）。在這些PROTACs中，DDC-01-163（25a）是Ba/F3和H1975細胞中對EGFRL858R/T790M最有效的降解劑。

       圖6. 基于EAI001的改良PROTAC在Ba/F3 EGFRL858R/T790M細胞中SAR

       除此之外，還有很多EGFR的PROTACs被報道，具體如圖7和圖8。

       圖7. EGFR的PROTACs

       圖8. EGFR的PROTACs

       國內(nèi)方面，在EGFR PROTAC上布局的藥企并不多。2023年1月10日，海思科自主研發(fā)的口服EGFR-PROTAC小分子抗腫瘤藥物HSK40118的臨床試驗申請獲得國家藥品監(jiān)督管理局受理，成為國內(nèi)首家申報EGFR PROTAC臨床的國內(nèi)藥企。去年4月，百濟神州曾公布了EGFR PROTAC專利。

       國外企業(yè)C4 Therapeutics在EGFR PROTAC布局較為靠前，其針對EGFR L858R突變的降解劑CFT8919已經(jīng)申報臨床。

       不過，目前EGFR PROTAC藥物仍然處于早期臨床階段，最終能否成功解決EGFR耐藥問題，還需要時間證明。

       靶向EGFR的新技術(shù)LYTAC

       2020年，Bertozzi等人開發(fā)了一種名為溶酶體靶向嵌合體（LYTACs）的新方法，以促進細胞外蛋白的降解，包括分泌蛋白、細胞表面受體和膜蛋白，通過溶酶體途徑。

       LYTAC系統(tǒng)包括2個主要部分，一部分是與待降解的底物蛋白對應的特異性抗體，可以特異性的結(jié)合需要降解的底物蛋白；另一部分是能與溶酶體靶向受體（LTRs）結(jié)合的含M6P支鏈的NCA聚糖肽（n=20~90），保證另一端的底物蛋白可以隨著LTR一起進入溶酶體然后完成降解。

       Bertozzi等人選擇FDA批準的EGFR抗體藥物西妥昔單抗來制造LYTAC，導致HeLa細胞中70%的EGFR降解。在第二代LYTACs中，通過基于DBCO-疊氮化物的點擊反應，將與新受體去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）結(jié)合的三能N-乙酰半乳糖胺（tri-GalNAc）基序與西妥昔單抗融合。這種基于配體的西妥昔單抗不僅表現(xiàn)出與第一代相當?shù)腅GFR降解，而且還實現(xiàn)了細胞類型選擇性。LYTACs的設計增強了對膜/細胞外蛋白的抑制，并帶來了基于抗體的治療的革新（圖9）[4]。

       圖9. A. CI-M6Pn LYTAC的一般代表；B. tri-GalNAc LYTAC的一般代表

       小     結(jié)

       EGFR一直是很熱門的腫瘤的靶點，目前市場上已經(jīng)有三代靶向小分子藥物上市，而且四代藥物也在研究中，但是不可避免都會出現(xiàn)耐藥性問題，為了避免這些問題，需要開發(fā)一些新的研究技術(shù)，包括PROTAC和LYTAC等。

       目前國內(nèi)外藥企關(guān)于EGFR的PROTACs布局的不多，可能是因為PROTACs的分子量大導致成藥性差，也可能是選擇性降解野生型和突變型EGFR蛋白的問題。未來在開發(fā)EGFR的PROTACs的問題上需要減少PROTACs的分子量來改善成藥性以及提高對野生型EGFR蛋白選擇性。希望未來可以利用EGFR的PROTACs技術(shù)解決耐藥性問題。

       關(guān)于EGFR的LYTACs的研究更少，LYTACs還有很多不足之處需要被完善，對于它的研究尚處于早期階段，未來還是有很大研究前景，令人期待。

       References

       1.Pritam Maity, Joydeep Chatterjee, Kiran T. Patil, Sahil Arora, Madhurendra K. Katiyar, Manvendra Kumar, Amirreza Samarbakhsh, Gaurav Joshi, Priyadeep Bhutani, Manoj Chugh, Navnath S. Gavande, and Raj Kumar, Targeting the Epidermal Growth Factor Receptor with Molecular Degraders: State-of-the-Art and Future Opportunities, J. Med. Chem. 2023, 66, 3135?3172.

       2.Dawei Hong, Bizhong Zhou, Bei Zhang, Hao Ren, Liquan Zhu, Guowan Zheng, Minghua Ge, Jingyan Ge, Recent advances in the development of EGFR degraders: PROTACs and LYTACs, European Journal of Medicinal Chemistry Volume 239, 5 September 2022, 114533.

       3.Qingqing Pan, Yao Lu, Li Xie, Di Wu, Rong Liu, Wenxia Gao, Kui Luo, Bin He, and Yuji Pu, Recent Advances in Boosting EGFR Tyrosine Kinase Inhibitors-Based Cancer Therapy, Mol. Pharmaceutics 2023, 20, 829?852.

       4.G. Ahn, S.M. Banik, C.L. Miller, N.M. Riley, J.R. Cochran, C.R. Bertozzi, LYTACs that engage the asialoglycoprotein receptor for targeted protein degradation Nat. Chem. Biol., 17 (2021), pp. 937-946.