【2025藥典搶先看】0512高效液相色譜法修訂內(nèi)容整理

       2023年4月24日，國家藥典委員會官網(wǎng)發(fā)布“關(guān)于通則0512高效液相色譜法修訂草案的公示”，擬對2020年版《中國藥典》第三部第456頁暨第四部第61頁收入的方法——0512高效液相色譜法部分內(nèi)容進行修訂，公示期自發(fā)布之日起3個月。高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，以下簡稱HPLC）是色譜法的一個重要領(lǐng)域之一，HPLC具有分析速度快、分離效能高、檢測靈敏度好等特點，已成為化學、醫(yī)藥工業(yè)等學科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)應用。

       一、了解色譜法常用專業(yè)術(shù)語

       1.高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，以下簡稱HPLC）：

       是指采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入色譜柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并進入檢測器檢測，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號。

       2.色譜分析法（Chromatography）：

       簡稱色譜法或?qū)游龇?，是一種物理或物理化學分離分析方法，該法利用某一特定的色譜系統(tǒng)（薄層色譜、高效液相色譜或氣相色譜等系統(tǒng)）進行混合物中各組分的分離分析。

       3.固定相：

       在色譜分離中固定不動，對樣品產(chǎn)生保留的一相。

       4.流動相：

       帶動樣品向前移動的另一相。

       5.保留時間(retention time，tR)：

       定義為被分離組分從進樣到柱后出現(xiàn)該組分最大響應值時的時間，也即從進樣到出現(xiàn)某組分色譜峰的頂點時為止所經(jīng)歷的時間，常以分鐘(min)為時間單位，用于反映被分離的組分在性質(zhì)上的差異。

       二、常見的HPLC色譜柱，你知道幾種？

       在藥品檢測領(lǐng)域，有“四大名譜”，它們分別為色譜、光譜、質(zhì)譜、波譜，可以說只要有分析任務(wù)的地方都在使用色譜分析法，《0512高效液相色譜法》收載的常用的HPLC色譜柱種類，分別是：

       1)反相色譜柱：以鍵合非極性基團的載體為填充劑填充而成的色譜柱。常見的載體有硅膠、聚合物復合硅膠和聚合物等；常用的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基硅烷鍵合硅膠等。

       2)正相色譜柱：用硅膠填充劑，或鍵合極性基團的硅膠填充而成的色譜柱。常見的填充劑有硅膠、氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠等。氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠也可用作反相色譜。

       3)離子交換色譜柱：用離子交換填充劑填充而成的色譜柱。有陽離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。

       4)手性分離色譜柱：用手性填充劑填充而成的色譜柱。

       三、新舊0512高效液相色譜法主要內(nèi)容搶先看

       根據(jù)2020年版《中國藥典》實施以來的反饋意見，結(jié)合各國藥典色譜法通則的修訂變化，此次有以下幾項內(nèi)容有發(fā)生變化，紅色字體為刪除內(nèi)容，藍色字體為增訂內(nèi)容變更主要內(nèi)容對照如下：

       1．進一步完善色譜參數(shù)調(diào)整范圍。

       （4）色譜參數(shù)調(diào)整品種正文項下規(guī)定的色譜條件（參數(shù)），除填充劑種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑與長度、填充劑粒徑、流動相流速、流動相組分比例、柱溫、進樣量、檢測器靈敏度等，均可適當調(diào)整。

       若需使用小粒徑（約2μm）填充劑和小內(nèi)徑（約2.1mm）色譜柱或表面多孔填充劑以提高分離度或縮短分析時間，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配，必要時，色譜條件（參數(shù)）可適當調(diào)整。

       色譜參數(shù)允許調(diào)整范圍見表。

表一色譜參數(shù)允許調(diào)整的范圍

       表 允許調(diào)整的色譜參數(shù)及范圍

       注：F1為調(diào)整前原規(guī)定流速；F2為調(diào)整后流速；dc1為調(diào)整前原規(guī)定色譜柱的內(nèi)徑；dc2為調(diào)整后色譜柱的內(nèi)徑；dp1為調(diào)整前原規(guī)定色譜柱的粒徑；dp2為調(diào)整后色譜柱的粒徑；Vinj1為調(diào)整前原規(guī)定進樣體積；Vinj2為調(diào)整后進樣體積；L1為調(diào)整前原規(guī)定色譜柱柱長；L2為調(diào)整后色譜柱柱長；tR為峰保留時間；Wh/2為峰半高峰寬。

       2．增加滯留體積對梯度分離影響的描述。

       可通過相關(guān)軟件計算表中流速、進樣體積和梯度洗脫程序的調(diào)整范圍，并根據(jù)色譜峰分離情況進行微調(diào)。

       調(diào)整后，系統(tǒng)適用性應符合要求，且色譜峰出峰順序不變。通常，較小的填充劑粒徑需增加線速度，較大的填充劑粒徑需降低線速度，在按上表調(diào)整流速時，要注意儀器的壓力限值。若減小進樣體積，應保證檢測限和峰面積的重復性；若增加進樣體積，應使分離度和線性關(guān)系仍滿足要求。

       對于梯度洗脫，柱尺寸（柱長和柱內(nèi)徑）改變導致柱體積改變，會影響控制選擇性的梯度洗脫體積。可通過調(diào)整梯度洗脫體積使其與柱體積成比例。由于梯度洗脫體積是梯度時間（tG）和流速F的乘積，因此需要對每個梯度段的梯度時間進行調(diào)整，以保持梯度洗脫體積與柱體積的比值恒定（表示為L×dc2）。由原來的梯度時間（tG1）、流速、柱長和柱內(nèi)徑，按下式計算新的梯度時間（tG2）。

       tG2=tG1×(F1/F2)×[(L2×dc)/(L1×dc)]

       梯度洗脫條件的調(diào)整可分步進行：（1）根據(jù)L/dp調(diào)整柱長和粒徑；（2）根據(jù)粒徑大小和柱內(nèi)徑的變化調(diào)整流速；（3）根據(jù)柱長、柱內(nèi)徑和流速的變化，調(diào)整每個梯度段的梯度時間。

       若減小進樣體積，應保證檢測限和峰面積的重復性；若增加進樣體積，應使分離度和線性關(guān)系仍滿足要求。應評價色譜參數(shù)調(diào)整對分離和檢測的影響，必要時對調(diào)整色譜參數(shù)后的方法進行確認。若調(diào)整超出表中規(guī)定的范圍或品種項下規(guī)定的范圍，被認為是對方法的修改，需要進行充分的方法學驗證。

       調(diào)整梯度洗脫色譜參數(shù)時應比調(diào)整等度洗脫色譜參數(shù)時更加謹慎，因為此調(diào)整可能會使某些峰位置變化，造成峰識別錯誤，或者與其他峰重疊。如梯度微調(diào)后仍不能滿足系統(tǒng)適用性要求，通常應考慮滯留體積的緣故或更換色譜柱。

       滯留體積（dwell volume，用D或VD表示)，也稱為梯度延遲體積，是指從流動相混合點至柱入口之間的體積。梯度洗脫時，所采用設(shè)備的配置可顯著地影響方法所述的分離度、保留時間和相對保留時間。如果發(fā)生這種情況，可歸因于過大的滯留體積。因此，應考慮方法開發(fā)時的系統(tǒng)與實際使用系統(tǒng)之間滯留體積的差異，在開始梯度程序前增加一個等度平衡階段，通過調(diào)整等度階段時間來調(diào)整梯度時間點，以與所使用的分析設(shè)備相適應。如在品種項下給出了方法開發(fā)時所

       用的滯留體積，則原梯度表中所述的時間點（t，min）可用按下式計算的調(diào)整后時間點（tc，min）代替：

       t_c=t- 

       式中D為實際使用的分析設(shè)備的滯留體積（ml）；

       D₀為方法開發(fā)時分析設(shè)備的滯留體積（ml）；

       F為流速（ml/min）。

       如驗證證明分析方法應用時不需等度平衡，則可省略這一等度階段。

       應評價色譜參數(shù)調(diào)整對分離和檢測效果的影響，必要時對調(diào)整色譜參數(shù)后的方法進行確認。多個參數(shù)的調(diào)整將對系統(tǒng)性能產(chǎn)生累積影響，需要作適當?shù)娘L險評估。

       對于組分或基質(zhì)特別復雜的體系，如中藥分析方法，進行其色譜參數(shù)調(diào)整時應特別謹慎。

       若調(diào)整超出表中規(guī)定的范圍或品種項下規(guī)定的范圍，被認為是對方法的修改，需要進行充分的方法學驗證。

       3．在第一節(jié)增加（5）溶液制備的描述。

       （5）溶液制備 為減少溶劑峰和色譜峰的畸變，制備供試品溶液和參比物質(zhì)溶液可用流動相（或梯度起始比例流動相組成）作為溶劑；為提高供試品中待測成分與參比物質(zhì)的保留時間和峰面積響應的一致性，制備供試品溶液和參比物質(zhì)溶液的溶劑組成盡可能保持一致。如供試品和/或參比物質(zhì)在流動相中的溶解性不夠，可先用流動相組成中具溶解能力的某一溶劑或其它適宜溶劑制備供試品溶液或/和參比物質(zhì)溶液貯備液，再用流動相（或梯度起始比例流動相組成）稀釋到測試的濃度。

       在測試序列中，應取制備溶液的溶劑和/或稀釋劑進樣以確認其是否對待測物質(zhì)峰有干擾。

       對于含量測定，單點對照法定量用供試品溶液與對照品溶液濃度應相同或相近，確保在分析方法線性范圍內(nèi)，并有足夠的精密度。

       對于限度檢測，如有關(guān)物質(zhì)檢測，除另有規(guī)定外，供試品溶液濃度應保證能準確檢測0.1%的雜質(zhì)，對照溶液或?qū)φ掌啡芤簼舛葢c所關(guān)注的限度濃度相當。

       4．對系統(tǒng)適用性試驗進行修訂和補充：

       a.明確分離度（Rs）應以半高峰寬（Wh/2）的計算結(jié)果為準。

       （2）分離度（Rs）......無論是定性鑒別分析還是定量測定，均要求待測物質(zhì)色譜峰與內(nèi)標物質(zhì)色譜峰或特定的雜質(zhì)對照色譜峰及其他雜質(zhì)色譜峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外，待測物質(zhì)色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應不小于1.5。分離度的計算公式為：

       式中tR2為相鄰兩色譜峰中后一峰的保留時間；

       tR1為相鄰兩色譜峰中前一峰的保留時間；

       W1、W2及Wh/2,1、Wh/2,2分別為此相鄰兩色譜峰的峰寬及半高峰寬，見下圖。

       當對測定結(jié)果有異議時，色譜柱的理論板數(shù)（n）和分離度（Rs）均應以峰寬 （W）半高峰寬（Wh/2）的計算結(jié)果為準。

       b.增加峰谷比（p/v）作為系統(tǒng)適用性的參數(shù)。

       （3）峰谷比若待測物質(zhì)峰與相鄰峰之間未達到基線分離，如在有關(guān)物質(zhì)檢測時，峰谷比（p/v）可作為系統(tǒng)適用性試驗參數(shù)。下圖表示部分分離兩個色譜峰的示意圖，峰谷比值計算公式為：

       式中Hp為小峰平行外推基線的高度

       H為小峰和大峰間曲線最低點平行外推基線的高度。

       峰谷比值計算示意圖

       c.定義靈敏度，修訂信噪比（S/N）計算公式。

       （4）靈敏度用于評價色譜系統(tǒng)檢測微量物質(zhì)的能力，通常以信噪比 （S/N）來表示。建立方法時，可通過測定一系列不同濃度的供試品或?qū)φ掌啡芤簛頊y定信噪比。定量測定時，信噪比應不小于10；定性測定時，信噪比應不小于3。系統(tǒng)適用性試驗中可以設(shè)置靈敏度實驗溶液來評價色譜系統(tǒng)的檢測能力。

       信噪比（S/N）用于定義系統(tǒng)的靈敏度，按下式計算：

       S/N=

       在使用規(guī)定的參比溶液獲得的色譜圖中， H為從目標峰最大值到基線信號的峰高，基線外延距離為目標峰半高峰寬的5倍；h距離為在目標峰5倍寬范圍內(nèi)觀察到的最大和最小噪聲的幅度，見下圖。如可能，應平均分布在目標峰的兩側(cè)。

       通常，定量限的信噪比應不小于10，檢測限的信噪比應不小于3。系統(tǒng)適用性試驗中可以設(shè)置靈敏度試驗溶液來評價色譜系統(tǒng)檢測低含量成分的能力。

       d.重新對拖尾因子（T）作出規(guī)定。

       （4）（5）拖尾因子（T）

       除另有規(guī)定外，在檢查和含量測定項下，以峰面積作定量參數(shù)時，T值應在0.8～1.8之間；以峰高作定量參數(shù)時，除另有規(guī)定外，T值應在0.95～1.05之間。

       以峰面積作定量參數(shù)時，一般的峰拖尾或前伸不會影響峰面積積分，但嚴重拖尾會影響基線和色譜峰起止的判斷和峰面積積分的準確性，此時應在品種正文項下對拖尾因子作出予以規(guī)定。

       e.修訂對重復性的要求。

       （6）重復性 用于評價色譜系統(tǒng)連續(xù)進樣時響應值的重復性能。除另 有規(guī)定外， 通常取各品種項下的對照品溶液或其它溶液，連續(xù)重復進樣 5 次， 其 峰面積響應測量值（或內(nèi)標比值或其校正因子）的相對標準偏差應不大于 2.0% ， 如品種項下規(guī)定相對標準偏差大于 2.0% ，則以重復進樣 6 次的數(shù)據(jù)計算。視進 樣溶液的濃度和/或體積、色譜峰響應和分析方法所能達到的精度水平等， 以滿足 檢測所需的精密度要求為前提， 對相對標準偏差的要求可適當放寬或收緊，放寬 或收緊的范圍以滿足品種項下檢測需要的精密度要求為準并在品種項下予以規(guī)定。

       f.增加保留時間和相對保留時間作為評價系統(tǒng)適用性參數(shù)的描述。

       （7）其他參數(shù)保留時間和相對保留時間常用于評價系統(tǒng)適用性，如在品種項下列出但未明確為系統(tǒng)適用性要求，它們僅作為一種參考。實驗得到的相對保留時間與品種項下規(guī)定值間的差異應為多少，沒有適用的可接受標準。

       g.對于復雜體系，提出可在品種項下附對照圖譜來評價系統(tǒng)適用性。

       對于復雜體系，可在品種項下附對照圖譜，通過供試品圖譜與對照圖譜的比對來評價系統(tǒng)適用性。

       上述系統(tǒng)適用性試驗及其可接受標準，根據(jù)方法驗證特別是耐用性試驗結(jié)果在品種項下描述。如上述的與品種項下描述的系統(tǒng)適用性試驗及其可接受標準不同，則以品種項下描述為準。

       除品種項下描述的任何其他系統(tǒng)適用性試驗及其標準外，不論品種項下描述與否，用于檢查或定量分析時，重復性試驗應滿足本通則或品種項下的要求。在整個分析過程中，色譜系統(tǒng)應滿足系統(tǒng)適用性要求，否則實驗結(jié)果不被接受。

       5．在測定法中增加校準曲線測定法。

       （6）校準曲線法

       對于復雜藥物體系中的成分和/或待測成分量在較大范圍變化的含量測定，可采用標準曲線法。標準曲線法可分為外標法和內(nèi)標法。

       ①外標校準曲線法：精密稱取對照品（或工作對照品）適量，或精密量取對照品儲備液適量，配制成不同濃度的系列溶液，精密量取系列溶液各適量，進樣，記錄色譜圖，測量峰響應，用峰響應對濃度繪制標準曲線，通過最小二乘法計算出回歸曲線方程。在相同的色譜條件下，再精密量取供試品溶液適量，進樣，記錄色譜圖，測量供試品溶液中待測成分的峰響應，由待測成分的峰響應和回歸曲線方程確定供試品溶液中待測成分的量。

       ②內(nèi)標校準曲線法：精密稱取對照品（或工作對照品）適量，或精密量取對照品儲備液適量，與精密量取的內(nèi)標溶液混合，配成含等量內(nèi)標物的不同濃度待測成分的系列溶液，精密量取系列溶液各適量，進樣，記錄色譜圖，測量待測成分和內(nèi)標物的峰響應比值，用峰響應比值對待測成分濃度繪制標準曲線，通過最小二乘法計算出回歸曲線方程。在相同的色譜條件下，再精密量取加有與對照品系列溶液相同量內(nèi)標物的供試品溶液，進樣，記錄色譜圖，測量供試品溶液中待測成分和內(nèi)標物的色譜峰響應比值，由待測成分的峰響應比值和回歸曲線方程確定供試品溶液中待測成分的量。

       如適用，也可使用其他方法如標準加入法、內(nèi)插法等，并在品種正文項下注明。

       參考文獻

       [1]www.chp.org.cn