降解物-抗體偶聯(lián)物（DAC），靶向降解新模式！

       背景介紹

       眾所周知，癌癥治療通常是基于化療藥物和靶向藥物的療法，因此需要藥物細(xì)胞毒 性和安全性?xún)蓚€(gè)方面的平衡。然而，即使靶向治療也不總是只針對(duì)異常的癌細(xì)胞，這些非特異性毒 性會(huì)導(dǎo)致治療指數(shù)低和副作用等問(wèn)題。而選擇性的藥物遞送策略可以最大限度地減少總體脫靶效應(yīng)。為了實(shí)現(xiàn)強(qiáng)效但有毒 藥物的高效遞送，將抗體結(jié)合到靶向特定抗原的ADC策略是藥物發(fā)現(xiàn)中新興的模式之一。

       近年來(lái)，靶向蛋白降解(TPD)技術(shù)，通常被稱(chēng)為靶向蛋白水解嵌合體(PROTACs)，已被廣泛應(yīng)用于藥物化學(xué)領(lǐng)域，其在針對(duì)不可成藥靶點(diǎn)以及克服耐藥性方面具有巨大優(yōu)勢(shì)。PROTACs是一種能降解細(xì)胞內(nèi)靶蛋白的異雙功能分子。

       然而，盡管TPD技術(shù)實(shí)現(xiàn)了不可成藥致病靶蛋白的降解，但正常細(xì)胞和癌細(xì)胞之間仍然缺乏選擇性，同樣可能會(huì)引起脫靶毒 性的問(wèn)題。此外，PROTAC的物理化學(xué)特性通常與較差的DMPK性質(zhì)和較低的生物利用度有關(guān)。因此，作為一種藥物遞送策略，降解劑-抗體偶聯(lián)物DAC可能為T(mén)PD領(lǐng)域提供了新的機(jī)會(huì)。通過(guò)DAC策略，降解劑可以特異性地遞送至癌癥相關(guān)細(xì)胞（圖1）。

       圖1.ADC與DAC

       PROTAC面臨的挑戰(zhàn)

       PROTAC分子有三個(gè)部分:靶蛋白配體，E3泛素連接酶配體，以及連接這兩個(gè)配體的連接鏈。通常，PROTAC不符合“類(lèi)藥五規(guī)則”特征，主要結(jié)構(gòu)特征是(i)高分子量(600 - 1000 Da)， (ii)大極性表面積(PSA > 200 Å)， (iii) >5氫鍵供體，(iv) >10氫鍵受體，(v)溶解性差，(vi)滲透性差。由于這些物理化學(xué)性質(zhì)，PROTAC通常具有較差的細(xì)胞攝取和生物利用度。

       研究發(fā)現(xiàn)，藥物遞送系統(tǒng)可以顯著改善PROTAC特性，并提高整體細(xì)胞滲透性和生物利用度。迄今為止，已經(jīng)報(bào)道了多種方法來(lái)遞送具有更高選擇性的藥物，如小分子藥物綴合物(SMDC)、納米載體和ADC等。這些藥物遞送體系有諸多優(yōu)點(diǎn)，例如：

       (i)克服PROTACs較差的生物利用度和DMPK特性

       (ii)避免復(fù)雜化學(xué)配方策略(iii)提供有效的轉(zhuǎn)運(yùn)和改善的吸收限制

       (iv)通過(guò)腫瘤特異性和組織特異性的傳遞，這些致病靶蛋白可以在改善的治療窗口中有效降解。

       ADC和DAC

       ADC和DAC的結(jié)構(gòu)組成相似，主要由單克隆抗體、附著位點(diǎn)、連接子和藥物組成（圖2）。只是ADC的載藥通常使用單功能小分子，DAC使用PROTACs。

       圖2. DAC與ADC的組成特征

       研究表明，抗體是有效載荷(如小分子毒素和PROTAC)特異性結(jié)合和傳遞的關(guān)鍵成分，以殺死和降解靶蛋白?？贵w的先決條件是(i)與具有較高腫瘤表達(dá)和有限正常細(xì)胞表達(dá)的明確抗原的特定相互作用;(ii)能夠保持其特性，如穩(wěn)定性、內(nèi)化能力以及與連接鏈和有效載荷的結(jié)合;和(iii)對(duì)目標(biāo)抗原的高度結(jié)合特異性。

       連接鏈技術(shù)主要分為兩類(lèi)。第一類(lèi)是具有三種釋放機(jī)制的可切割連接鏈:溶酶體蛋白酶敏感(肽)、酸敏感(腙)和谷胱甘肽敏感(二硫)連接鏈。第二類(lèi)是不可切割的連接鏈(硫醚和其他)，與可切割的連接鏈相比，不可切割的連接鏈在循環(huán)中表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。

       此外，ADC和DAC的最后一個(gè)組成成分是有效載荷。ADC通常會(huì)釋放小分子毒素，而DAC是為PROTAC和分子膠設(shè)計(jì)的。同樣的原理也適用于ADC和DAC：選擇性運(yùn)輸毒素或PROTACs，同時(shí)最大限度地減少脫靶效應(yīng)。

       ADC中的有效載荷具有更強(qiáng)的細(xì)胞結(jié)合親和力。因此，有效載荷的數(shù)量(DAR，藥物-抗體比)通常是4 - 8或2 - 6，這取決于偶聯(lián)方法。相比之下，DAC所需的DAR高于ADC，因?yàn)镻ROTAC分子通常比ADC毒素具有更弱的效力。由于有效載荷的數(shù)量和連接鏈的化學(xué)性質(zhì)，通常會(huì)出現(xiàn)聚集、低療效和藥代動(dòng)力學(xué)問(wèn)題。

       DAC作用機(jī)制

       ADC和DAC的原理基本相同（圖3）。在給藥后，整個(gè)DAC應(yīng)盡可能保持系統(tǒng)穩(wěn)定，以防止PROTACs過(guò)早釋放和血液循環(huán)。首先，DAC的抗體部分識(shí)別細(xì)胞表面的腫瘤相關(guān)抗原。其次，DAC -抗體復(fù)合物通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)行內(nèi)化。在細(xì)胞內(nèi)，復(fù)合物與核內(nèi)體融合并被運(yùn)送到活化的溶酶體。在蛋白水解和酸性環(huán)境下，復(fù)合物連接子被降解，負(fù)載物(PROTAC)隨后被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。根據(jù)DAC細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)，可誘導(dǎo)蛋白降解事件的發(fā)生。

       圖3.DAC的作用機(jī)制

       DAC研究現(xiàn)狀

       靶向BRD4的 DAC

       研究表明，由于BRD4在癌癥發(fā)展過(guò)程中作為轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)控因子的關(guān)鍵作用，引起了人們對(duì)新型BRD4降解物以及BRD4抑制劑的高度關(guān)注。第一個(gè)報(bào)道的DAC由一種靶向C型凝集素樣分子-1 (CLL1)的單克隆抗體(mAb)和BRD4降解劑1 GNE-987組成。研究人員通過(guò)在BET結(jié)合片段上引入二氫吡咯吡啶酮支架，發(fā)現(xiàn)了一種用于急性髓系白血病(AML)的強(qiáng)效BRD4降解物1。盡管化合物1具有BRD4高效降解能力和較強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用，但體外和體內(nèi)不利的DMPK特性影響了進(jìn)一步的效果。

       由于CLL1抗原在AML細(xì)胞表面高度表達(dá)，因此在AML異種移植模型中開(kāi)發(fā)了一種新型靶向CLL1- DAC的方法。研究人員采用“直接二硫”偶聯(lián)策略，使用含有活化的二硫鍵的甲硫磺酰(MTS)基團(tuán)與CLL1靶向抗體上的6個(gè)半胱氨酸殘基(DAR≈6.0)偶聯(lián)，且沒(méi)有顯著的聚集問(wèn)題（圖4）。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抗體偶聯(lián)策略增強(qiáng)了嵌合降解物，克服了不良降解物的藥代動(dòng)力學(xué)特性。此外，DAC 4的藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估顯示了高水平的體內(nèi)穩(wěn)定性。

       圖4.靶向CLL1的BRD4 DAC的設(shè)計(jì)

       STEAP1在前列腺癌中高度表達(dá)，靶向STEAP1的ADC也被報(bào)道在患者來(lái)源的前列腺癌模型中具有抗原依賴(lài)性的體內(nèi)療效。Dragovich等人利用化合物2作為BRD4的降解物和一種識(shí)別前列腺六跨膜上皮抗原(STEAP1)細(xì)胞表面抗原的抗體。最初，他們通過(guò)亞甲基烷氧基氨基甲酸酯部分將2連接到一個(gè)組織蛋白酶B可切割的擬肽連接物上，然后將該連接物與一個(gè)靶向SETAP1的單抗結(jié)合，以產(chǎn)生DAC 5a (DAR≈2.0)。

       遺憾的是，與降解物2相比，DAC 5a表現(xiàn)出較差的BRD4降解。此外，靶向CLL1的對(duì)照偶聯(lián)物5b顯示BRD4降解類(lèi)似于5a。然而，通過(guò)進(jìn)一步的“高DAR”策略得到了DAC 5c (DAR≈6.0)，與5a相比，DAC 5c的BRD4降解效果有所改善（圖5）。然而，也有研究表明，連接更多的降解劑（高DAR）并不是開(kāi)發(fā)更有效的DAC的方法。

       圖5. 靶向STEAP1 的BRD4 DAC的設(shè)計(jì)

       2020年，Maneiro等人報(bào)道了HER2依賴(lài)的BRD4降解的DAC。研究人員將降解物3 (ARV-771)偶聯(lián)到靶向HER22的曲妥珠單抗(赫賽汀)。與此前DAC制備方法略有不同，他們利用無(wú)銅催化的疊氮-炔環(huán)環(huán)加成反應(yīng)(SPAAC)將 PROTAC 3a與單克隆抗體連接而成，得到了一種新的DAC 12（DAR為4）。研究發(fā)現(xiàn)，DAC 12具有較好的穩(wěn)定性，在HER2+細(xì)胞中顯示出選擇性降解BRD4蛋白（圖6）。

       圖6.靶向HER2的BRD4 DAC的設(shè)計(jì)

       靶向Erα DAC

       除了靶向BRD4的DAC, Dragovich等人還報(bào)道了兩種不同的er α靶向降解物13和15。降解劑13由選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑他莫西芬與連接酶配體XIAP組成，并顯示出強(qiáng)大的降解Erα效果。

       研究人員以他莫西芬的羥基為連接位點(diǎn)，使用纈氨酸-瓜氨酸-對(duì)氨基芐氧基連接鏈與HER2 單克隆抗體結(jié)合的他莫西芬羥基位點(diǎn)，得到了降解劑14（圖7），并成功地證明了目標(biāo)蛋白的降解。

       圖7.靶向HER2的Erα DAC

       研究人員進(jìn)一步用基于VHL配體的PROTAC 15，合成了新型的靶向HER2的Erα DAC。研究人員選用VHL的羥基為連接位點(diǎn)，將碳酸基二硫連接劑和焦磷酸二酯基連接劑應(yīng)用于相應(yīng)的DAC 16和17（圖8）。然而，這些降解物表現(xiàn)出中等的穩(wěn)定性，需要進(jìn)一步優(yōu)化提高穩(wěn)定性。

       圖8.基于VHL配體的靶向HER2的Erα DAC

       靶向BRM的DAC

       BRM蛋白，也被稱(chēng)為SMARCA2，在包括癌癥在內(nèi)的各種人類(lèi)疾病中被廣泛發(fā)現(xiàn)。降解物20最初由Arvinas和Genentech于2019年開(kāi)發(fā)，是BRM的選擇性降解劑。后來(lái)，Genentech進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了一個(gè)基于降解物20的DAC 21，主要通過(guò)使用二硫基連接鏈將降解物20和選擇性結(jié)合CD22細(xì)胞表面受體的單抗進(jìn)行共價(jià)連接（圖9）。此外，后續(xù)異種腫瘤移植實(shí)驗(yàn)證明DAC 21可以實(shí)現(xiàn)BRM蛋白的高效降解和細(xì)胞抗原依賴(lài)性降解。

       圖9. BRM的DAC 21的設(shè)計(jì)

       小                  結(jié)

       靶向蛋白降解技術(shù)作為一種新的研究策略，已顯示出極大的臨床潛力。然而，由于它們固有的理化特性，往往造成了較差的體內(nèi)外效果。為了克服這些挑戰(zhàn)，研究人員設(shè)計(jì)了不同的藥物遞送系統(tǒng)。

       降解物-抗體DAC策略為PROTAC分子提供了更好的特性，如溶解度、細(xì)胞內(nèi)積累、位點(diǎn)特異性分布和減少副作用。因此，DAC是藥物化學(xué)中最有前途的新模式之一。但DAC仍有改進(jìn)的空間，如提高靶點(diǎn)選擇性和驗(yàn)證連接鏈和降解物與抗體之間的位置等。總而言之，這種DAC的藥物模式大大克服了PROTAC所面臨的各種問(wèn)題，有望成為一種治療多種人類(lèi)疾病的候選藥物。

       參考文獻(xiàn)

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