分析檢測(cè)支持伴隨著生物藥開發(fā)的各個(gè)階段，根據(jù)不同的檢測(cè)目的，檢測(cè)人員會(huì)選擇相應(yīng)的分析方法。例如在早期的藥物發(fā)現(xiàn)階段，由于材料受限以及對(duì)檢測(cè)速度的要求，通常選擇高靈敏度、高通量的分析方法來進(jìn)行篩選和檢測(cè)；而在藥物開發(fā)后期，檢測(cè)量要求放低，但要求檢測(cè)方法具有穩(wěn)定性，且相對(duì)比較常規(guī)。今天我們圍繞抗體偶聯(lián)藥物（ADC）的質(zhì)量分析研究進(jìn)行分享。
ADC藥物的分析和表征包括多個(gè)方面：
● 一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸序列的分析、完整抗體的分析
● 高級(jí)結(jié)構(gòu)的二硫鍵分析、自由巰基的分析、圓二色譜、紅外以及DSC的分析
● 純度和異質(zhì)性需要進(jìn)行SEC、CE以及IEX檢測(cè)
● 生物活性的檢測(cè)，包括了抗原抗體結(jié)合活性/細(xì)胞活性的檢測(cè)、ADCC/CDC的檢測(cè)
● ADC特異檢測(cè)，包括DAR值分析、小分子分布的分析、Free drug檢測(cè)、空載linker比率的檢測(cè)、小分子偶聯(lián)位點(diǎn)的檢測(cè)
● 翻譯后修飾的檢測(cè)，包括糖基化分析、氧化、脫酰胺化、糖化以及N端和C端的分析
● 此外還有很多常規(guī)的分析，例如三大殘留、吐溫分析、無菌等
ADC藥物的質(zhì)量屬性涉及到大分子的質(zhì)量屬性、ADC特有的質(zhì)量屬性以及小分子相關(guān)的質(zhì)量屬性。
● ADC中與大分子相關(guān)的質(zhì)量屬性檢測(cè)包括：完整分子量、肽圖、聚體、碎片、電荷異質(zhì)性、翻譯后修飾以及大分子活性相關(guān)的檢測(cè)；
● ADC特有的質(zhì)量屬性相關(guān)檢測(cè)包括：裸抗、DAR值分析、小分子藥物分布、偶聯(lián)位點(diǎn)的分析；
● 小分子相關(guān)的質(zhì)量屬性包含：Free drug及相關(guān)雜質(zhì)、小分子活性檢測(cè)以及其他雜質(zhì)的分析，如有機(jī)試劑殘留、重金屬殘留等。
以定點(diǎn)偶聯(lián)為例，定點(diǎn)偶聯(lián)通常對(duì)半胱氨酸進(jìn)行工程化改造，引入非天然的氨基酸或是用酶進(jìn)行偶聯(lián)，這種偶聯(lián)方法制備的ADC通常是均質(zhì)的。半胱氨酸偶聯(lián)的ADC通常連接在鏈間二硫鍵，小分子以0、2、4、6、8的形式連接在抗體上，可以用疏水色譜或反向色譜進(jìn)行DAR值的分析。
下圖為疏水色譜檢測(cè)半胱氨酸偶聯(lián)ADC的結(jié)果。由圖可知，疏水色譜對(duì)于連接了0、2、4、6、8個(gè)小分子藥的ADC分離效果較好，通過對(duì)譜圖進(jìn)行積分即可計(jì)算DAR值。使用反向色譜檢測(cè)ADC也可以進(jìn)行DAR值的計(jì)算，在檢測(cè)前需要先對(duì)ADC進(jìn)行還原，得到譜圖后發(fā)現(xiàn)反相色譜對(duì)輕鏈帶一個(gè)小分子藥、重鏈帶1、2、3個(gè)小分子藥的不同ADC均能良好分離，也可以通過譜圖積分進(jìn)行DAR值的計(jì)算。
對(duì)于賴氨酸偶聯(lián)的ADC藥物，例如T-DM1，可以采用LC-MS對(duì)小分子藥的分布進(jìn)行大概的分析及DAR值計(jì)算。使用紫外分析時(shí)，在252 nm處會(huì)出現(xiàn)小分子特定吸收峰，280 nm處出現(xiàn)蛋白特定吸收峰。根據(jù)朗伯比爾定律，可以計(jì)算出該ADC的DAR值。iCIEF同樣可以檢測(cè)ADC藥物的小分子分布情況。隨著等電點(diǎn)升高，ADC偶聯(lián)的小分子數(shù)量會(huì)減少。
T-DM1的偶聯(lián)分為兩步來實(shí)現(xiàn)：第一步是通過還原的方法，將SMCC隨機(jī)偶聯(lián)到抗體的賴氨酸位點(diǎn)上，在這個(gè)過程中MCC中的馬來酰亞胺可能發(fā)生邁克爾加成作用，在分子間或是分子內(nèi)部形成T-MCC共價(jià)交聯(lián)，這種共價(jià)鍵無法通過還原來打斷。
下圖是對(duì)連接上小分子的T-DM1以及只做了一步偶聯(lián)的T-MCC進(jìn)行了CE分析的結(jié)果。nrCE的譜圖中主峰之后出現(xiàn)的小峰，推測(cè)是共價(jià)交聯(lián)導(dǎo)致的。rCE譜圖中重鏈后出現(xiàn)的峰，也是共價(jià)交聯(lián)引起的。
東曜藥業(yè)對(duì)自身生產(chǎn)的T-DM1與羅氏所生產(chǎn)的原研Kadcyla®進(jìn)行了相似性研究，基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，對(duì)不同的質(zhì)量屬性進(jìn)行分級(jí)，并設(shè)定了三種不同的可接受標(biāo)準(zhǔn)。
?第一層級(jí)
可以直接反映ADC作用機(jī)制，并且對(duì)臨床輸出有很大影響的質(zhì)量屬性歸類為第一層級(jí)，如增殖抑制實(shí)驗(yàn)。第一層級(jí)使用等價(jià)實(shí)驗(yàn)作為可接受標(biāo)準(zhǔn)。在90%的置信區(qū)間，相似藥與參照藥均值的差值要在參照藥均值的±1.5倍SD范圍內(nèi)。
?第二層級(jí)
對(duì)于臨床輸出影響中等的質(zhì)量屬性歸為第二層級(jí)，使用質(zhì)量范圍作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，例如Her-2抗原抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。第二層級(jí)要求相似藥有大于90%的批次是在參照藥均值的±3倍SD范圍內(nèi)。
?第三層級(jí)
對(duì)臨床輸出影響較小的質(zhì)量屬性歸為第三層級(jí)，通常進(jìn)行譜圖比較，如肽圖。經(jīng)過分析，東曜藥業(yè)生產(chǎn)的T-DM1與Kadcyla®的肽圖具有很高的相似度（見下圖）。
東曜藥業(yè)提供從臨床前到臨床以及商業(yè)化生產(chǎn)等不同階段服務(wù)，包括技術(shù)開發(fā)、分析方法的開發(fā)和驗(yàn)證、技術(shù)轉(zhuǎn)移、工藝的表征和驗(yàn)證等，具備生化分析、理化分析、細(xì)胞活性分析以及表征能力：
生化分析包括抗原抗體結(jié)合、三大殘留的檢測(cè)、FC受體結(jié)合、基因拷貝數(shù)以及支原體的檢測(cè)等；
理化分析包括蛋白含量、純度分析、肽圖分析、電荷異質(zhì)性、DAR值分析、N糖、唾液酸殘留檢測(cè)以及吐溫檢測(cè)等；
細(xì)胞活性包括細(xì)胞毒檢測(cè)、ADCC/CDC免疫功能實(shí)驗(yàn)、報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、基因表達(dá)、病毒的含量；
表征可以實(shí)現(xiàn)完整抗體還原抗體分子量的檢測(cè)序列覆蓋度、二硫鍵翻譯后修飾，以及 ADC相關(guān)檢測(cè)，例如小分子分布、空載linker的比率分析等；
方法驗(yàn)證遵照 ICH Q2指導(dǎo)原則，符合中國(guó)、美國(guó)以及歐洲的藥典標(biāo)準(zhǔn)?；诓煌哪康?，可以對(duì)專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、檢測(cè)限、定量限、線性范圍以及耐用性做不同程度的驗(yàn)證。
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