多發(fā)性骨髓瘤治療靶點(diǎn)：CRL4 E3連接酶

       多發(fā)性骨髓瘤（MM）是第二大最常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，在臨床病征上容易復(fù)發(fā)。而免疫調(diào)節(jié)藥物（IMiDs）的引入可以說(shuō)是多發(fā)性骨髓瘤治療中可顯著改善患者預(yù)后的一個(gè)重要里程碑。目前，IMiDs是新診斷和復(fù)發(fā)/難治性骨髓瘤治療的基礎(chǔ)。

       研究表明，IMiDs主要通過(guò)結(jié)合CRL4 E3泛素連接酶 (CRL4^CRBN) 復(fù)合物的底物受體蛋白Cereblon (CRBN) 發(fā)揮其抗骨髓瘤活性。通過(guò)結(jié)合CRBN，IMiDs改變了其底物的特性，導(dǎo)致骨髓瘤細(xì)胞存活所必需的蛋白質(zhì)的泛素化和蛋白酶體降解。

       隨著IMiDs的成功，這引發(fā)了許多學(xué)者使用CRL4^CRBN復(fù)合物的活性對(duì)治療骨髓瘤的可能性作進(jìn)一步探索。在本文中，探討了骨髓瘤治療領(lǐng)域中的新角色，即CRBN E3連接酶調(diào)節(jié)劑（CELMODs）的研究現(xiàn)狀，這是新一代具有更廣泛生物活性的IMIDs。此外，我們還討論了一種新型靶向蛋白水解策略，即靶向蛋白水解嵌合體（PROTACs），利用CRL4-CRBN降解可能與骨髓瘤和其他惡性腫瘤的治療有關(guān)的不可成藥的蛋白質(zhì)。

       背景介紹

       泛素-蛋白酶體途徑在蛋白質(zhì)降解過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。這一過(guò)程是由參與泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)的一系列酶反應(yīng)介導(dǎo)的，這些酶反應(yīng)在整個(gè)泛素化途徑中會(huì)被ATP循環(huán)和激活，其中E3的作用是確定蛋白酶體中泛素化和隨后降解的底物特異性。

       人類基因組編碼600多個(gè)E3泛素連接酶中，cullin-ring泛素連接酶（CRLs）是最大的E3連接酶家族，參與許多細(xì)胞穩(wěn)態(tài)過(guò)程，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和胚胎發(fā)育等。CRL4 E3泛素連接酶是由鋅指結(jié)構(gòu)域蛋白(ROC1，也稱為RBX1)、Cullin4(Cul4)支架蛋白和DDB1-Cul4相關(guān)蛋白組成的復(fù)合物，決定了CRL4 E3活性的底物特異性。cereblon（cereblon,CRBN）是CRL4 E3底物受體之一，對(duì)免疫調(diào)節(jié)藥物等小分子的作用至關(guān)重要。通過(guò)IMiDs靶向CRBN可改變其對(duì)非生理蛋白的底物特異性，這些蛋白隨后可被相應(yīng)的蛋白酶體識(shí)別和降解。（圖1A）

       而這種作用機(jī)制在多發(fā)性骨髓瘤(MM)的治療中顯示出特別的相關(guān)性，所以 IMiDs的引入改變了MM患者的傳統(tǒng)治療藥物，且顯著改善了他們的預(yù)后。

       雖然作用于CRBN的E3連接酶相關(guān)功能似乎是IMiDs 抗骨髓瘤活性的主要機(jī)制，但最近的報(bào)道表明，IMiDs也通過(guò)調(diào)節(jié)CRBN的其他特性（如伴侶功能）發(fā)揮作用。因此，為了強(qiáng)調(diào)更廣泛的生物活性，下一代的免疫調(diào)節(jié)劑被稱為“celmod”（Cereblon E3連接酶調(diào)節(jié)劑）。近年來(lái)，CRL4^CRBN復(fù)合物和其他E3連接酶被廣泛探索為通過(guò)異雙功能小分子降解典型的“不可成藥”蛋白的靶點(diǎn)，稱為蛋白水解靶向嵌合體（PROTACs）。

       本文主要介紹了在多發(fā)性骨髓瘤未來(lái)的治療方法中，以CRBN依賴的方式調(diào)節(jié)CRL4^CRBN E3連接酶活性的方法。

       圖1.CRL4^CRBN E3連接酶復(fù)合物泛素化研究進(jìn)展

       免疫調(diào)節(jié)藥物（IMiDs）

       1、 IMiDs的作用機(jī)制

       在2006年引入的沙利度胺是第一類的免疫調(diào)節(jié)劑，是MM治療的里程碑之一。連同其新一代的衍生物里，如來(lái)那度胺和泊馬度胺，以及蛋白酶體抑制劑和單克隆抗體，這些藥物被用于治療MM患者。沙利度胺及其類似物在闡明其作用機(jī)制之前，主要被認(rèn)為是通過(guò)誘導(dǎo)IL-2(interleukin)和干擾素-γ等細(xì)胞因子的產(chǎn)生來(lái)調(diào)節(jié)T細(xì)胞、NK和NK-T細(xì)胞的功能。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，沙利度胺及其類似物除了具有抗血管生成、破壞骨髓瘤細(xì)胞-骨髓基質(zhì)相互作用和降低破骨細(xì)胞生成等作用外，故被稱為免疫調(diào)節(jié)藥物。隨后研究表明，CRBN的表達(dá)是IMiDs抗骨髓瘤活性所必需的，因?yàn)檠芯堪l(fā)現(xiàn)CRBN基因的敲除導(dǎo)致了骨髓瘤細(xì)胞對(duì)來(lái)那度胺和泊馬度胺產(chǎn)生了耐藥性。

       2014年，研究人員首次闡明了免疫調(diào)節(jié)劑的關(guān)鍵作用機(jī)制。兩項(xiàng)研究表明，來(lái)那度胺與CRBN的相互作用改變了其底物特異性，從而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子IZKF1/ 3的蛋白酶體依賴性降解。IKZF1和IKZF3被定義為CRBN的“新底物”，因?yàn)樗鼈冎挥性诖嬖贗MIDs的情況下才成為CrBN的靶標(biāo)。IKZF1/3的降解調(diào)控IRF4和MYC等其他基因的表達(dá)，對(duì)MM細(xì)胞的增殖和存活至關(guān)重要。而IKZF1/3-IRF4-MYC轉(zhuǎn)錄軸的破壞在MM細(xì)胞存活中起到了關(guān)鍵性作用 ，與原發(fā)性積液淋巴瘤細(xì)胞系的研究相反，其中IMiDs獨(dú)立于IKZF1和IKZF3觸發(fā)IRF4的表達(dá)下調(diào)。

       最近的研究報(bào)道了多種潛在的IMIDs新底物，這些新底物需要在生理?xiàng)l件下驗(yàn)證并轉(zhuǎn)化為IMIDs的臨床應(yīng)用。在IMiDs的作用下， CRL4^CRBN E3連接酶的可以與新底物發(fā)生相互作用。在IMiDs活性下降解的新底物庫(kù)的差異可能反映了在MM治療期間觀察到的各種不良事件。沙利度胺最常見(jiàn)的副作用是慢性軸突神經(jīng)病變，而其他以骨髓抑制為特征的藥物是最常見(jiàn)的毒 性。來(lái)那度胺和波馬利度胺的骨髓抑制作用是指IKZF1的降解和隨后下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子PU.1和GATA1，前后兩者分別導(dǎo)致中性粒細(xì)胞減少和血小板減少。由于與沙那度胺和波馬利度胺相比，沙利度胺對(duì)IKZF的降解作用要低得多，它可能不會(huì)像它的新衍生物那樣引起這種毒 性。

       此外，IMiDs還可以調(diào)節(jié)CRL4^CRBN E3連接酶的活性，以降解與特定新底物具有不同親和力的各種蛋白。底物特異性的獨(dú)特模式可能會(huì)轉(zhuǎn)化為這些藥物的臨床療效和毒 性特征的多樣性。

       2.2.IMiDs的臨床療效

       盡管自來(lái)那度胺引入以來(lái)，沙利度胺在MM治療中的作用一直在穩(wěn)步下降，但在許多來(lái)那度胺供應(yīng)不足的國(guó)家，沙利度胺、地塞米松和硼替佐米(VTD)的聯(lián)合仍是初診MM患者的關(guān)鍵方法，這些患者有資格接受大劑量化療，隨后進(jìn)行自體干細(xì)胞移植（Auto-HSCT）。最近，Auto-HSCT前的VTD(沙利度胺聯(lián)合長(zhǎng)春新堿V以及吡喃阿霉素T和地塞米松D治療方案)誘導(dǎo)已被證明在近95%的患者中發(fā)揮了有效反應(yīng)（至少部分反應(yīng)部分緩解)，證實(shí)了以前報(bào)道的結(jié)果。

       如最近的第3期Cassiopeia試驗(yàn)所示，通過(guò)添加Daratumumab可以進(jìn)一步提高VTD在反應(yīng)深度、可測(cè)量殘留疾病(MRD)陰性率和無(wú)進(jìn)展生存率(PFS)方面的臨床益處，Daratumumab是一種針對(duì)CD38的一流單克隆抗體，即通常在MM細(xì)胞表面表達(dá)的抗原。

       復(fù)發(fā)/難治性MM的治療是臨床實(shí)踐中的一大挑戰(zhàn)。對(duì)于以前沒(méi)有接觸過(guò)來(lái)那度胺的患者，單獨(dú)使用來(lái)那度胺（特別是在虛弱患者中），或與卡非佐米（Aspire試驗(yàn)）Ixazomib（電氣石試驗(yàn)），Daratumumab（Pollox試驗(yàn)）或Elotuzumab（Eloquent-2試驗(yàn)）聯(lián)合使用是高度相關(guān)的治療選擇。

       反過(guò)來(lái)，對(duì)于來(lái)那度胺難治患者，除了無(wú)IMID方案（如DKD[CANDOR試驗(yàn)]，DVD[Castor試驗(yàn)]和KD[Endeavor試驗(yàn)]外，以泊那度胺為基礎(chǔ)的方案也具有重要的臨床價(jià)值。根據(jù)以前的治療、表現(xiàn)狀況和共病情況，復(fù)發(fā)/難治性MM患者可以單獨(dú)或與抗CD38抗體（即達(dá)拉圖單抗（Apollo試驗(yàn)）或伊沙妥昔單抗[ICARIA-MM試驗(yàn)]、伊洛妥珠單抗（Eloquent-3試驗(yàn)）、蛋白酶體抑制劑（即硼替佐米[OptimisMM試驗(yàn)][65]、卡非佐米[66]和伊沙佐米以及細(xì)胞毒 性藥物（如環(huán)磷酰胺）聯(lián)合使用，但這最終還是要取決于復(fù)發(fā)/難治性MM患者。免疫調(diào)節(jié)劑隨機(jī)臨床試驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)在（表1）中。

       表1. IMIDS隨機(jī)臨床試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)

       CRBN E3連接酶調(diào)節(jié)劑（CELMODs）

       1、Celmods的作用機(jī)制

       盡管 關(guān)于免疫調(diào)節(jié)藥物（IMiDs）之間的作用機(jī)制仍未完全闡明，但已有研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)于CELMODs結(jié)構(gòu)的第二個(gè)擴(kuò)展區(qū)域（對(duì)應(yīng)于沙利度胺中的鄰苯二甲酰亞胺環(huán)）在每個(gè) CELMoD 之間變化，并決定與 CRBN 和新的 CRL4^CRBN E3 底物的相互作用，如圖 2A、B所示。

       圖2.IMIDs/CELMoDs在化學(xué)結(jié)構(gòu)和IKZF1降解能力方面的差異。

       區(qū)分CELMoDs與IMiDs的關(guān)鍵功能之一是CELMoDs增強(qiáng)了對(duì)CRBN的親和力。盡管如此，與來(lái)那度胺或波馬利多胺相比，CELMoDs的CRBN親和力大約高10-20倍。與經(jīng)典IMiDs相比，觀察到CELMODs在IKZF1和IKZF3降解中更強(qiáng)的效力（圖2C）。

       圖2.IMIDs和CELMODs的在IKZF中降解效力的比較

       3.2CELMODS的臨床療效

       （1）CC-92480（美齊格米特）

       最近報(bào)道了臨床1/2階段CC-92480-MM-002研究的初步結(jié)果。共19例復(fù)發(fā)/難治性MM患者在前一治療中位數(shù)為3（范圍，2-4)線后接受了CC-92480（美齊多米）、硼替佐米和地塞米松的聯(lián)合治療。

       （2）伊伯多胺(CC-220)

       根據(jù)1/2期CC-220-MM-001研究(NCT02773030)的初步結(jié)果顯示，三聯(lián)用伊伯多胺(CC-220)在重度預(yù)處理的MM患者中顯示出良好的安全性和臨床活性。Iberdomiddaratumumab-地塞米松(IBERDD)隊(duì)列分別包括63%和58%的DaratumumaMability和四重難治（定義為對(duì)≥1個(gè)亞胺、1個(gè)PI、1個(gè)抗CD38單克隆抗體和1個(gè)類固醇的難治）患者。同樣，在伊伯多胺-硼替佐米-地塞米松（IBERVD）隊(duì)列中，難治性患者的比例很高（PI型難治性，76%；4型難治性，48%)。然而，IBERDD組和IBERVD組的客觀反應(yīng)率分別為35%和50%。

       重要的是，對(duì)Ibervd的反應(yīng)與Daratumumab和Bortezomiberefrictory無(wú)關(guān)。值得強(qiáng)調(diào)的是，很大一部分患者從以伊伯多胺為基礎(chǔ)的治療中獲得了臨床益處，因?yàn)楂@得了最小的反應(yīng)或穩(wěn)定的疾病。臨床獲益率和疾病控制率分別為47%和88%（IBERDD隊(duì)列）和65%和85%（IBERVD隊(duì)列）。細(xì)胞減少是聯(lián)合治療最常見(jiàn)的并發(fā)癥。IBERDD聯(lián)合治療復(fù)發(fā)/難治性MM計(jì)劃在第3期Excaliber-RRMM試驗(yàn)(NCT04975997)中與DRD進(jìn)行比較。

       此外，IBERVD作為不符合HDT-Auto-HSCT條件的MM患者的一線治療方法，將在2期Borealis試驗(yàn)(NCT05272826)中進(jìn)行評(píng)估。在1/2期CC-220-MM-001研究(NCT02773030)中，對(duì)伊伯多胺聯(lián)合地塞米松進(jìn)行了評(píng)估。107例入組患者幾乎全部為三重難治（IMID、PI和抗CD38單克隆抗體難治），25%有髓外疾病，30%有高危細(xì)胞遺傳學(xué)。依伯多胺和地塞米松治療導(dǎo)致26%的患者有反應(yīng)。中位PFS和OS分別為3個(gè)月和11個(gè)月。

       有趣的是，以前接受過(guò)抗BCMA治療的患者有類似的反應(yīng)率（ORR為25%）人們對(duì)聯(lián)合療法的毒 性沒(méi)有出現(xiàn)新的擔(dān)憂。伊伯多米-地塞米松聯(lián)合其他抗骨髓瘤藥物如卡非佐米(NCT05199311,NCT02773030)、伊沙佐米(NCT04998786)、環(huán)磷酰胺(NCT04392037)和idecabtagene Vicleucel（Karmma-7試驗(yàn)，NCT04855136)的有效性和安全性目前正在幾項(xiàng)早期研究中進(jìn)行調(diào)查。

       靶向蛋白水解嵌合體（PROTACs）

       選擇性蛋白質(zhì)降解技術(shù)是一種極具臨床潛力的的治療策略，這種治療方法不單單適用于MM患者。PROTAC策略是通過(guò)募集E3泛素連接酶，使其對(duì)目標(biāo)靶向的蛋白質(zhì)（POIs）泛素化和降解。近年來(lái)，隨著對(duì)泛素化作用機(jī)制的廣泛研究推動(dòng)了PROTAC降解劑的發(fā)展。PROTAC分子由三個(gè)部位組成：

       （1）一種與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的小分子化合物。

       （2）一種與E3泛素連接酶特異性結(jié)合的化合物。

       （3）一種連接靶蛋白配體和E3泛素連接酶配體的連接鏈。

       PROTAC技術(shù)不需要與目標(biāo)蛋白的較高結(jié)合力，因此在克服經(jīng)典小分子蛋白抑制劑的潛在局限性（非共價(jià)抑制劑的瞬時(shí)靶向，蛋白質(zhì)過(guò)表達(dá)或點(diǎn)突變引起的耐藥性）方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。這種新的策略可以有效針對(duì)“不可成藥”靶點(diǎn)，如關(guān)鍵的致癌蛋白。

       圖3. PROTAC介導(dǎo)的靶向蛋白質(zhì)降解的機(jī)制

       目前，大多數(shù)PROTACs使用CRL4^CRBN和VHL兩種E3泛素連接酶作為招募連接酶。因此，IMIDs通常被認(rèn)為是PROTAC“分子膠”部分的先驅(qū)，因?yàn)樗鼈兇龠M(jìn)了CRBN與許多治療相關(guān)的新底物的相互作用的發(fā)現(xiàn)。

       2015年開(kāi)發(fā)了第一個(gè)基于CRBN的靶向降解BRD4的PROTAC，以沙利度胺為CRBN E3泛素連接酶配體和溴結(jié)構(gòu)域作為靶向蛋白。結(jié)果表明，DBET1在MM和AML細(xì)胞系中誘導(dǎo)高選擇性的CRBN依賴性BET蛋白降解?；贑RL4^CRBN-聚馬立度胺相互作用的下一代PROTACs也針對(duì)BET蛋白(ARV825)，該P(yáng)ROTAC顯示出對(duì)MM細(xì)胞較強(qiáng)的抑制活性，并且在小鼠移植瘤模型中也表現(xiàn)出較好的抑制效果。此外，研究人員還開(kāi)發(fā)了針對(duì)其他 MM 有前景的癌蛋白（如 CDK4 和 CDK6 和 MCL-1）的有效 PROTAC。

       值得注意的是，使用 IMiD 或 CELMoD 治療期間不可避免出現(xiàn) MM 細(xì)胞的獲得性耐藥，這可能會(huì)造成CRBN 表達(dá)改變和編碼 CRBN 的基因突變來(lái)影響基于CRL4^CRBN E3 泛素連接酶的 PROTAC 的療效。幸運(yùn)的是，人類基因組編碼了 600 多種 E3 泛素連接酶。到目前為止，只有少數(shù)幾種被用于 PROTAC 的生成：VHL、MDM2、IAP（凋亡蛋白抑制劑）和 CRBN。

       2022年8月，ARV-110(Adrent，NCT0388861)和ARV-471(Veritac，NCT04072952)的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行第二階段試驗(yàn)。在血液學(xué)領(lǐng)域，具有IMiD樣活性 (NX-2127) 的首 個(gè)口服BTK降解劑的人類1期試驗(yàn)?zāi)壳罢谡心紡?fù)發(fā)/難治性B細(xì)胞惡性腫瘤患者 (nct04830137)。同樣的，另一種基于IMID的BTK降解劑(NX-5948)已進(jìn)入1期試驗(yàn)，用于復(fù)發(fā)/難治性B細(xì)胞惡性腫瘤的患者，包括原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(NCT05131022)。最近，同樣基于IMID的STAT3降解劑(KT-333)被批準(zhǔn)用于治療成人難治性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤和實(shí)體瘤，正處于臨床I期試驗(yàn)。

       小結(jié)

       IMIDS的引入徹底改變了多發(fā)性骨髓瘤的治療前景，并與抗癌療法聯(lián)用顯著改善了MM治療結(jié)果。沙利度胺從致畸的“黑暗藥物”到第一類IMID的發(fā)現(xiàn)，以及對(duì)其作用機(jī)制的廣泛研究，為我們精確和重新理解蛋白質(zhì)泛素化過(guò)程提供了一個(gè)全新的視角。盡管IMIDs是MM治療中最重要的藥物之一，但針對(duì)IMIDs的適應(yīng)癥也正在擴(kuò)大到其他惡性腫瘤領(lǐng)域，如血液系統(tǒng)惡性腫瘤。例如，來(lái)那度胺對(duì)復(fù)發(fā)的套細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤和邊緣區(qū)淋巴瘤均有療效。期待更多的IMIDs獲批上市，為患者帶來(lái)福音。

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