細胞分子穿肽設(shè)計

       生物體按照蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，即氨基酸序列，將蛋白質(zhì)折疊和組裝到更高級別的空間構(gòu)象組織（二級、三級和四級結(jié)構(gòu)）?；谙嗤脑?，短肽也能夠采取空間二級結(jié)構(gòu)，例如α螺旋和β折疊。

       這些構(gòu)象通常是由弱的非共價相互作用驅(qū)動的，例如靜電相互作用、氫鍵、疏水作用或范德華力。此外，雙親短肽由于肽單體之間的分子間弱相互作用而易于自組裝。化學的進步為分子設(shè)計提供了一種程序設(shè)計和控制的環(huán)境：本文將重點論述細胞穿透肽（Cell Penetrating Peptides, CPPs）分子設(shè)計方面的最新進展。

       細胞穿透肽的應(yīng)用及化學結(jié)構(gòu)特征

       細胞穿透肽是一類長約5~30個氨基酸的短肽，能夠攜帶多肽，核酸，小分子藥物及病毒顆粒穿透細胞膜進入細胞。人們用其作為載體，將運載物轉(zhuǎn)運進入細胞。過去的研究證明，用細胞穿透肽攜帶蛋白質(zhì)和多肽治療癌癥和炎癥性疾病的小鼠模型是有效的。基于動物實驗研究，人們認為細胞穿透肽攜帶DNA或SiRNA治療疾病將成為可能。

       細胞穿透肽還可以提高病毒轉(zhuǎn)染的效率。因此，對于這種即可幫助治療疾病，又有可能助紂為虐，加速病毒傳播的雙刃劍，人們更需要加大研究力度以趨利避害。另外，細胞穿透肽可以攜帶熒光或放 射性試劑用于成像應(yīng)用。總之，細胞穿透肽攜帶治療基因或者藥物分子進入細胞將有非常廣闊的臨床應(yīng)用前景。

       細胞穿透肽數(shù)據(jù)庫于 2012 年建立，由印度 Indraprastha Institue of Information Technology創(chuàng)建，現(xiàn)已更新至2.0 版，對于細胞穿透肽的分子設(shè)計具有很強的指導(dǎo)作用。細胞穿透肽數(shù)據(jù)庫顯示了 1699 個獨特的細胞穿透肽序列，大多數(shù)是直鏈多肽（94.5%）。攜帶分子方面主要用于熒光團的傳遞 (54%) ，與生物醫(yī)學相關(guān)的主要貨物分子是核酸（15%）。其余的貨物分子主要包括蛋白質(zhì) (9%)、生物素（8%）、納米粒子 (7%) 和肽藥物(4%) 。細胞穿透肽的研究主體集中在全L-氨基酸 (84.3%) 構(gòu)成的合成多肽(54.8%) 。此外，全D-氨基酸組成的細胞穿透肽的內(nèi)化效率和穩(wěn)定性，以及由 L- 和 D-氨基酸混合組成的細胞穿透肽，也有相關(guān)的文獻報道。（圖 1）

       圖1. 細胞穿透肽數(shù)據(jù)圖

       常規(guī)的細胞穿透肽的分子設(shè)計都繞不開以下三個關(guān)鍵參數(shù)：胍基含量（或者陽離子氨基酸含量）、疏水性和雙親性。富含精氨酸（精氨酸側(cè)鏈為胍基，pKa約為12，在生理pH條件下為質(zhì)子化的胍基陽離子）的細胞穿透肽，在一級結(jié)構(gòu)-功效領(lǐng)域經(jīng)受了深入的研究。

       在研究細胞穿透肽的氨基酸序列以及單個氨基酸殘基（例如正電荷）貢獻方面，膜模型，膜提取物以及體內(nèi)研究起到非常關(guān)鍵的角色，這些研究都對細胞穿透肽的分子設(shè)計起到了指導(dǎo)作用。盡管存在這些理論指導(dǎo)，單從多肽序列預(yù)測它的膜穿透性仍然非常困難。

       除了序列之外。多種化學和物理化學性質(zhì)，例如電荷、手性、芳香性和疏水性，及其相互作用通常是細胞穿透肽內(nèi)化的重要驅(qū)動力。可以說，多肽序列是基礎(chǔ)，在這個基礎(chǔ)之上的分子間的相互作用，決定了細胞穿透肽的功效。要設(shè)計出高效的細胞穿透肽，包括電荷、胍基、手性、疏水性和芳香性在內(nèi)的眾多參數(shù)，它們之間的相互作用，需進一步的深入研究。

       基于以上考慮，細胞穿透肽的構(gòu)效關(guān)系和雙親多肽的空間構(gòu)象得到了充分的研究。電荷與雙親性是細胞穿透肽分子設(shè)計時需要考慮的兩個主要因素。細胞穿透肽的內(nèi)化效果會因雙親性和多陽離子的整體特性而發(fā)生變化。除此之外，多肽序列長度與空間構(gòu)象對于多肽內(nèi)化有著與多陽離子性同等重要的地位。

       富集陽離子對細胞穿透肽的意義

       富含側(cè)鏈陽離子氨基酸的肽序列在細胞穿透肽領(lǐng)域可謂至關(guān)重要。Tat肽（圖2） 的發(fā)現(xiàn)，是細胞穿透肽領(lǐng)域具有里程碑意義的事件。Tat (反式激活轉(zhuǎn)錄激活劑, Transactivating transcriptional activator) 肽是人類免疫缺陷病毒 (HIV-1)的原始轉(zhuǎn)錄激活因子中殘基 48 至 60 的肽片段。Tat 改性的基因傳遞系統(tǒng)顯示出增強的跨多個生物膜（例如細胞膜、內(nèi)體膜和核膜）的轉(zhuǎn)運功能。

       圖2. Tat肽化學結(jié)構(gòu)

       Tat肽包含六個精氨酸和兩個賴氨酸殘基，它們都屬于堿性氨基酸，側(cè)鏈分別為胍基和氨基，在生理pH條件下都因質(zhì)子化帶有正電荷。鑒于Tat的重大指導(dǎo)意義，最簡單的細胞穿透肽模擬物設(shè)計為寡聚精氨酸也就不足為奇了。

       細胞穿透肽的內(nèi)化效果與陽離子殘基之間的相關(guān)性已經(jīng)得到了證實。受到Tat (GRKKRRQRRRPQ) 和滲透素(RQIKIWFQNRRMKWKK) 的啟發(fā)，細胞穿透肽的分子設(shè)計主要集中在小的陽離子肽（攜帶5個左右的正電荷），例如聚精氨酸和聚賴氨酸肽。研究最深入的細胞穿透肽模型，是基于寡精氨酸的R8 和 R9 （8個或9個連續(xù)精氨酸殘基的多肽，圖3）。

       聚陽離子細胞穿透肽的吸收效率取決于序列長度以及精氨酸殘基在多肽序列的位置。據(jù)報道環(huán)化可最大限度地增加精氨酸與細胞膜之間的作用，從而實現(xiàn)更高的吸收效率。除了精氨酸側(cè)鏈的胍基之外，多肽所帶的正電荷也可以通過其他氨基酸側(cè)鏈引入，例如賴氨酸（側(cè)鏈氨基）和組氨酸（側(cè)鏈咪唑基）。然而，聚精氨酸的內(nèi)化表現(xiàn)優(yōu)于聚賴氨酸和聚組氨酸 。因此，就內(nèi)化和引入機制而言，聚精氨酸也是研究最深入細胞穿透多肽。線性聚精氨酸的內(nèi)化效率取決于序列長度以及精氨酸殘基的數(shù)量和位置。胍基團具有與膜之間形成雙齒氫鍵的能力膜，因此其多肽內(nèi)化應(yīng)該與膜易位相關(guān)（圖4）。

       圖3. R8/9多肽化學結(jié)構(gòu)

       圖4. 精氨酸與賴氨酸同細胞膜表面磷脂基團形成的雙齒和單齒氫鍵示意圖。

       疏水性和芳香性結(jié)構(gòu)對細胞穿透肽的意義

       除了陽離子部分，親脂性部分對細胞吸收也很重要。對此，研究者提出了一種機制，認為富含胍基的細胞穿透肽，其主鏈附近形成了疏水性的反（陰）離子，對于細胞穿透肽的內(nèi)化起到作用。反離子效應(yīng)首先表現(xiàn)為精氨酸殘基與膜組分之間的氫鍵相互作用，形成能夠穿過膜的復(fù)合物 。與此形成對比的是，富含賴氨酸的多肽中沒有觀察到這種強烈的反離子結(jié)合，這一發(fā)現(xiàn)反向證明了胍基反離子對于促進細胞穿透肽內(nèi)化的相關(guān)性。細胞穿透肽這種與疏水性反離子結(jié)合的特性稱為這些肽的自激活特性。因此在關(guān)注多肽攜帶正電荷的同時，不可忽略細胞穿透肽疏水性研究，以及單一脂肪和芳香官能團的貢獻。

       疏水性可以通過添加脂肪族或芳香族結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)。一些細胞穿透肽模擬物的研究證實，芳香族活化性優(yōu)于脂肪族。 脂化是通過將不同長度的烴鏈（烷基）連接到已知細胞穿透肽的N端 或其它合適的官能團上。這種烷基化改性通過增強與膜的疏水相互作用提高細胞穿透肽的內(nèi)化效果。除了整合脂肪鏈外，多肽分子疏水性的提高也可以通過引入疏水性氨基酸（例如亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸）來實現(xiàn)。有報道稱，在使用更疏水的丁基替換甲基之后，一個細胞穿透肽的活性提升了三倍。8 與之相應(yīng)的是，在同一項研究中，當 γ-dimethylsilaproline取代脯氨酸Pro構(gòu)建一個具有聚脯氨酸PPII螺旋結(jié)構(gòu)的細胞穿透肽 （圖5），其內(nèi)化效率得到了提高。這個結(jié)果可能歸結(jié)于多肽整體疏水性增加。

       圖5. 脯氨酸與γ-dimethylsilaproline化學結(jié)構(gòu)

       最近報道了一個具有細胞穿透特性的疏水性病毒肽gH 625（序列：HGLASTLTRWAHYNALIRAF，圖6）。 這種細胞穿透肽的設(shè)計來源于單純皰疹病毒I 型，用于運載脂質(zhì)體 、量子點 、樹枝狀大分子 、無序蛋白質(zhì) 和 SPIONS (Superparamagnetic iron oxide nanoparticles, 超順磁性氧化鐵納米粒子)。其化學結(jié)構(gòu)的雙親性也得到明顯體現(xiàn)。

       圖6. Gh 625疏水性細胞穿透肽結(jié)構(gòu)（紅色部分為疏水性氨基酸殘基）

       多肽疏水性也可以通過芳香族氨基酸殘基（色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸）的引入得以增強。根據(jù) Wimley 和 White 的說法，芳香族殘基在多肽插入細胞膜雙層界面的過程中具有優(yōu)勢的自由能。芘、暈苯和富勒烯被證明可以激發(fā)胍基陽離子的活化，從而使富含精氨酸的細胞穿透肽穿越細胞膜。

       研究者又通過一系列實驗驗證，在保持多肽疏水性相同的前提下，芳香族官能團是否比脂肪族官能團提供更好的內(nèi)化效率。這些研究發(fā)現(xiàn)，相較于脂肪鏈來說，芳香官能團更有助于細胞穿透肽的內(nèi)化。因為芳香族多肽可以同膜蛋白上的芳香氨基酸產(chǎn)生π-π 作用，它們可能有助于促進或穩(wěn)定 多肽與膜的相互作用并幫助內(nèi)化。8這個概念被擴展至各種 π作用（π-π、π-陽離子、π-陰離子 和 π-偶極）對于多肽分子內(nèi)化的影響。

       陽離子與疏水結(jié)構(gòu)的綜合考慮

       在細胞滲透肽的分子設(shè)計中，陽離子與疏水性特征需要綜合考慮。滲透素多肽（penetratin）就是這樣的例子（圖7）。滲透素是從一個果蠅同源域蛋白中得到的。滲透素與質(zhì)膜的非極性部分的非靜電相互作用對于內(nèi)化很重要（這也解釋了雙親分子設(shè)計的基礎(chǔ)，滲透中包含亮氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等非極性氨基酸殘基）。陽離子殘基的數(shù)量、它們在一級結(jié)構(gòu)上的間距，在二級結(jié)構(gòu)上的相對位置，以及包含非肽元素（例如疏水性脂質(zhì)部分）的整合，對于細胞穿透肽的分子設(shè)計非常關(guān)鍵。

       圖7. 滲透素化學結(jié)構(gòu)（藍色為帶陽離子的氨基酸殘基，紅色部分為疏水結(jié)構(gòu)）

       另一個例子是 Pep-1，它包括5個色氨酸（疏水性氨基酸，以增強多肽與細胞膜的疏水性作用）和帶正電荷的富含賴氨酸的片段 (KKKRKV,來自于病毒SV-40 T-抗原上的核定位序列nuclear localization sequence), 以及一個脯氨酸間隔，以增加多肽的柔性。

       同樣，MPG肽 (GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV) 的設(shè)計理念是包含相同的親水性核定位序列，并將該序列與HIV-gp-41病毒片段的一個疏水序列偶合所得。把陽離子氨基酸殘基、疏水性片段，以及雙親結(jié)構(gòu)以不同的方式整合在同一多肽分子中，就可以構(gòu)造和衍生出更多高效的細胞穿透肽。

       半胱氨酸細胞穿透肽

       面對細胞穿透肽功能實現(xiàn)過程中的種種挑戰(zhàn)，諸如內(nèi)化效率，內(nèi)體逃逸效率、循環(huán)時間，以及特異性和選擇性方面（對于細胞、組織、疾?。┑膯栴}，細胞穿透肽設(shè)計已取得了相應(yīng)的進展。其中的一個例子是富含半胱氨酸 (Cys) 的細胞穿透肽。

       該分子設(shè)計的靈感來自于在蛇毒中發(fā)現(xiàn)的一種毒素克羅胺 （Crotamine，圖8），它包含兩個核定位域（crot（2-18）和crot（27-39））。通過檢查crot（27-39）(序列：KMDCRWRWKCCKK)，研究者利用氨基酸殘基的系統(tǒng)替換和/或省略，以及深入的構(gòu)效研究，設(shè)計出一種富含半胱氨酸的十肽 (CRWRWKCCKK) 分子（圖9）。這種潛在的細胞穿透肽具有增強的內(nèi)化效率。

       圖8. 克羅胺Crotamine蛋白結(jié)構(gòu)（圖片來源：PDB: 1H5O）

       圖9. 克羅胺Crotamine核定位片段Crot (27-39) (上圖) 與細胞穿透十肽（下圖）分子結(jié)構(gòu)對比（藍色為保留部分）。

       單環(huán)、雙環(huán)和三環(huán)細胞穿透肽

       細胞穿透肽已成為細胞內(nèi)治療劑的熱門研究領(lǐng)域。因為直鏈細胞穿透肽的天然限制，諸如內(nèi)體包埋、毒 性、細胞特異性差、穩(wěn)定性差和降解性強，以及不完 美的細胞滲透， 改性的細胞穿透環(huán)肽應(yīng)運而生。相對于其直鏈前體，細胞穿透環(huán)肽具有增強的細胞穿透能力和改善的物化性質(zhì)，以及抵抗水解降解的穩(wěn)定性。一些細胞穿透環(huán)肽可以表現(xiàn)出不依賴內(nèi)體的攝取的特質(zhì)， 已報道了一些細胞穿透環(huán)肽具有核瞄準特性。

       圖10展示了一些具有精氨酸和其它氨基酸 殘基的單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)結(jié)構(gòu)的細胞穿透環(huán)肽。

       圖10. 包含精氨酸與色氨酸殘基的單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)細胞穿透環(huán)肽的化學結(jié)構(gòu)。

       [WR]4 和 [WR]5兩個細胞穿透環(huán)肽結(jié)構(gòu)單元的特征表現(xiàn)在交替正電荷（精氨酸）與疏水性氨基酸（色氨酸）在序列中的出現(xiàn)。含有色氨酸和精氨酸殘基的單環(huán)細胞穿透環(huán)肽也可與潛在的治療藥物偶聯(lián)。例如，單環(huán)肽與多柔比星、紫杉醇和喜樹堿偶合， 其中多柔比星-環(huán)肽的加合物展示了內(nèi)化作用的效果。

       除此之外，幾種含有半胱氨酸和精氨酸殘基的單環(huán)肽，也顯著增強了細胞對不可滲透的磷酸肽（F')-Gly-(pTyr)-Glu-Glu-Ile (F'-GpYEEI)的吸收。含有色氨酸和組氨酸的環(huán)十肽有效增加了細胞不可滲透的磷酸肽與抗 HIV 藥物恩曲他濱（emtricitabine）的細胞內(nèi)傳遞。 [WR]4-[WR]4-[WR]4 三環(huán)肽含有交替的精氨酸與色氨酸殘基，它提高了 F'-GpYEEI 和熒光標記的抗 HIV 藥物 (拉米夫定 (3TC)、恩曲他濱 (FTC) 和 siRNA) 的乳腺癌細胞系 MDA-MB-231的細胞攝取。

       在以上的細胞穿透環(huán)肽中，色氨酸和精氨酸殘基的連續(xù)排列組合，衍生出了具有不同細胞傳遞特性的不同類型細胞穿透環(huán)肽。這些數(shù)據(jù)揭示了單環(huán)、雙環(huán)和三環(huán)細胞穿透肽的分子運輸潛力，并為設(shè)計下一代藥物遞送肽提供了良好的基礎(chǔ)。

       總結(jié)

       需要注意的是，本文在討論細胞穿透肽的分子設(shè)計時，只介紹了多肽一級結(jié)構(gòu)，也就是氨基酸序列方面的影響。由于篇幅原因，暫時沒有介紹二級結(jié)構(gòu)對于細胞穿透肽的活性。

       盡管目前文獻報道的細胞穿透肽的分子設(shè)計非常詳盡，但將其轉(zhuǎn)化為臨床環(huán)境仍然是一個艱巨的挑戰(zhàn)。細胞穿透肽的應(yīng)用領(lǐng)域廣闊且在不斷發(fā)展，更深入的機理探索導(dǎo)致了分子設(shè)計復(fù)雜性的增加。這其中包括開發(fā)穩(wěn)定并且多域的環(huán)狀或自組裝納米結(jié)構(gòu)。此外，選擇性、靶向性、高效率等方面也需要進一步發(fā)展。許多研究人員提出了通過可控的空間折疊、環(huán)化、二聚、訂合、自組裝，甚至不同主鏈的多肽模擬物的方式，以達到提高細胞穿透肽的穩(wěn)定性和活性的目的。

       然而，由于各種復(fù)雜內(nèi)化機理的研究發(fā)展，疾病的異質(zhì)性，以及可用于體外研究的細胞系種類繁多，時至今日仍然沒有統(tǒng)一標準，來評估一種分子設(shè)計相對于另一種設(shè)計的內(nèi)化效率改進。此外，龐大的異質(zhì)性貨物分子意味著，在評估細胞穿透肽的效率與活性的過程中，需要考慮更多的參數(shù)。在這方面，需要標準化的統(tǒng)一以及更多深入對比研究，以度量不同類型的細胞穿透肽的表現(xiàn)。雖然細胞穿透肽設(shè)計已經(jīng)取得了巨大的進步，但在這一領(lǐng)域無疑仍有很廣闊的發(fā)展空間。

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