CAR-T治療貴在哪里？從制備過程和成本構成解讀

       CAR-T治療究竟貴在哪里。

       CAR-T療法：是指通過基因克隆技術對具有免疫球蛋白（Ig）的抗原結合區(qū)的T細胞受體進行基因改造，將帶有特異性抗原識別結構及T細胞激活信號的遺傳物質轉入T細胞，使T細胞直接與腫瘤細胞表面的特異性抗原相結合而被激活。CAR識別腫瘤抗原后，激活T細胞的免疫通路，相關基因表達上調，分泌顆粒酶、穿孔素等物質直接介導腫瘤細胞溶解，同時分泌粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、干擾素-γ（IFNγ）等炎癥因子，招募巨噬細胞等固有免疫細胞響應殺傷腫瘤組織，從而治療癌癥。

       CAR分子結構：CAR主要由識別腫瘤特異性抗原的單鏈抗體（scFV）段、鉸鏈區(qū)及跨膜段、共刺激分子結構域、CD3ζ結構域構成。通過將編碼CAR的基因引入T細胞，從最初一代CAR-T細胞發(fā)展到目前的第四代CAR-T細胞經歷了30年的發(fā)展時間。

       圖1 CAR-T細胞結構演變

       表1 四代CAR-T細胞結構的發(fā)展

       01

       CAR-T制備流程復雜，耗時較長

       目前上市的CAR-T產品均為自體細胞來源，自體CAR-T制備首先將病人的白細胞（WBCs）通過血細胞去除法分離后洗滌獲得。然后，T細胞被激活，轉導CAR基因，擴增到一定數量后罐裝和密封后用于治療。CAR-T細胞制備主要包括以下步驟：

       圖2 臨床規(guī)模自體CAR-T細胞療法的制備過程

       （1）單采白細胞及細胞清洗

       在CAR-T療法中患者的白細胞需要先被從體內提取出來之后，對之加以改造使其表達CAR-T，而后再輸回患者體內。由于白細胞重量異于其他血液成分，利用密度梯度離心法從患者（已上市產品）或健康志愿者（發(fā)展趨勢）外周血中分離白細胞，常用的血液成分分離機包括：Trima、UVAR-XTS、COBE Spectra，之后洗滌去除白細胞分離過程中添加的抗凝劑。

       （2）富集T細胞并激活

       生產CAR-T時所用的T細胞富集手段一般是單抗磁珠富集法，T細胞通過CD4/CD8特異性抗體或者表面標記偶聯磁珠進行分離，然后加入CD3/CD28單克隆抗體磁珠或人工抗原提呈細胞等對細胞培養(yǎng)基中的T細胞進行激活，這其實是模擬正常身體環(huán)境中樹狀細胞對休眠T細胞的刺激，并使其迅速活化。因為僅有活化后的T細胞能夠快速分裂，且T細胞僅在活化后方能針對某一特定抗原分泌大量抗體。

       （3）基因傳遞/轉染

       這是制備CAR-T的關鍵，使用慢病毒/逆轉錄病毒載體或非病毒方法（電轉DNA、轉座子/轉座子系統(tǒng)）將CAR轉染到T細胞中，CAR基因是T細胞準確識別腫瘤細胞的“眼睛”，載體的導入效率影響著CAR-T產品的成本和質量。理想的載體應具有較高的基因轉染效率，穩(wěn)定性好，不引起機體免疫反應等特點，目前已開展的臨床試驗以病毒載體轉導為主。

       圖3 CAR基因的導入的主要方式

       γ-逆轉錄病毒載體是第一個用于人類的基因轉導系統(tǒng)，臨床應用未發(fā)生與基因插入誘變相關的不良反應，它屬于一種RNA病毒。首先需要通過將包裝有CAR基因序列和LTR序列、gag和pol基因系列、env基因系列的三個質粒導入宿主細胞，通過宿主細胞的細胞器復制/轉錄出病毒蛋白和所需的基因序列，并包裝成攜帶CAR基因的γ-逆轉錄病毒載體。載體和活化的T細胞膜融合后，釋放CAR基因，沿著微管被運輸到細胞核（得益于核膜被破壞），并整合進T細胞基因組之后進行轉錄表達得到CAR蛋白。

       慢病毒載體相對γ-逆轉錄病毒轉導質量更加，因而在臨床上應用最多，但是由于二者為隨機整合，仍然存在一定的安全風險；慢病毒載體具有更高的寄送效率和T細胞轉導質量，慢病毒傳染的CAR-T顯示出更顯著的抗腫瘤效力，是目前的主流遞送載體，轉染過程與逆轉錄病毒類似。可轉導靜止和活化的T細胞，轉到效率接近100%，轉基因負荷量可達8kb，基因**更小，整合位點相比γ-逆轉錄病毒更安全但成本更高。

       目前絕大多數CAR-T細胞CAR的轉染都是基于病毒載體，但是病毒載體的制造過程復雜，成本昂貴且受到嚴格控制。監(jiān)管上病毒載體在臨床試驗的早期階段難以符合GMP（藥物質量管理規(guī)范）的所有方面。因此，以轉座子技術的非病毒基因傳遞是研發(fā)熱點，轉座子系統(tǒng)發(fā)生基因整合具有一定的靶向性，且成本低，有較大的潛力發(fā)展成為臨床通用的T細胞基因轉導系統(tǒng)。轉座子基因載體由一個攜帶CAR（轉座子）的質粒和一個攜帶轉座子酶的質粒組成，質粒經電穿孔進入T細胞，轉座酶被表達后作用于CAR側翼的末端導致重復序列，導致在T細胞基因組的TA二核苷酸序列上進行切除和整合，插入CAR基因，轉錄表達后在細胞表面生成CAR。目前有基于Sleeping Beauty(SB，“睡美人”)轉座系統(tǒng)和基于PiggyBac(PB)的轉座系統(tǒng)。

       mRNA電穿孔是將CAR基因導入T細胞最簡單和最安全的方法，但是mRNA的不穩(wěn)定性要求進行多次的T細胞輸注。

       表2 CAR基因轉導方法對比

       （4）細胞擴增培養(yǎng)

       通過生物反應器等細胞培養(yǎng)設備對T細胞進行擴增培養(yǎng)?；颊呱砩现荒芊蛛x少量的淋巴細胞，大多數有白細胞減少癥和其他并發(fā)癥，需要將適宜的T淋巴細胞擴增以達到治療目的。有許多患者最終無法接受CAR-T治療，原因就在于這些患者的T細胞無法在體外充分擴增，未達到目標劑量。CAR-T細胞擴增需要一個封閉、自動化和受控的擴增平臺。細胞培養(yǎng)可以通過不同的容器進行擴增，包括T瓶、平板或培養(yǎng)袋以及生物反應器。利用搖擺式生物反應器（例如WAVE）進行擴增是目前主要的培養(yǎng)方式，除此之外，自動化的細胞培養(yǎng)生產設備（例如CliniMACS Prodigy）也能夠產生大量的CAR-T，這種自動化的設備比起搖擺式生物反應器大大減少人為操作。

       圖4 T細胞培養(yǎng)過程

       （5）冷凍及運輸，最終回輸患者

       根據配方調整細胞數和培養(yǎng)基成分，然后將產品轉移到合適的容器中進行冷凍及運輸，最終回輸到患者。將復制擴增好的T細胞用靜脈輸液的方式輸入患者體內，有效增加血液內殺傷性T細胞的數量，識別腫瘤細胞起到有效殺滅腫瘤細胞的目的。聯合靜脈輸注+局部注射CAR-T細胞治療復發(fā)性彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）結外病變，患者獲得持久緩解，無嚴重不良反應，靜脈輸液+局部注射可能成為部分患者更優(yōu)回輸途徑。

       02

       CAR-T細胞復雜的制備工藝帶來高昂成本

       CAR-T細胞規(guī)模生產中的影響因素

       根據已披露的臨床試驗，CAR-T療法從白細胞采集到回輸的時間大多在10-25天左右，獲取并激活T細胞耗時1天，載體轉染耗時2天，擴大培養(yǎng)耗時7天左右，制備及質控耗時3天左右。其中Kymriah制備耗時為22天，Yescarta為17天。雖然目前的細胞療法開發(fā)過程中基本方案類似，但是工業(yè)界還沒有開發(fā)出一個成熟的，完全可被接受的CAR-T生產工藝，許多CAR-T產品使用人工操作，非常耗時耗力，而且難以擴大，失敗率高。整個CAR-T制備工藝非常復雜，而相對應的其生產工藝過程的優(yōu)化卻較為緩慢。

       如前所述，相當大的可變因素可能會阻礙CAR-T細胞的制造，CAR-T細胞制造中變異的主要來源——

       （A）操作變異(方法、人員、設備)：這主要是操作員/操作設備變化的結果，特別是在使用手動式處理系統(tǒng)時，完全自動化的制造程序可以將操作變異帶來的影響降至最低；

       （B）原材料和試劑（血清、培養(yǎng)基、生長因子等）：用于更好實現細胞擴增的培養(yǎng)基和試劑（例如細胞生長因子）目前尚未標準化，原材料和試劑如果根據GMP規(guī)范制造可能難以獲得；

       （C）環(huán)境變量（溫度、粒子數、氣體張力、濕度）：在CAR-T細胞制造過程中應監(jiān)測環(huán)境參數以確保制造過程一致性，確保產品質量和無菌性，在理論上這些方面可以通過功能封閉的系統(tǒng)實現；

       （D）生物因素（起始材料質量和組成）：這是最重要的因素。生物因素是CAR-T細胞制造中不可避免的變量 ，其中最重要的可變性包括：細胞活力、T細胞含量、健康狀況和表型。

       另外不同患者的輔助細胞也會有很大的差異，例如巨噬細胞和單核細胞。但是細胞治療產品質量控制的安全性、純度、效力以及均一性會貫穿CAR-T生產的各個階段，這也增加了CAR-T治療的成本。

       圖5 CAR-T細胞規(guī)模生產中的變量

       CAR-T細胞制備的成本構成，耗材占用總成本的一半

       Kymriah在美國定價為47.5萬美元/針，Yescarta在美國定價為37.3萬美元/針，在中國上市的奕凱達和倍諾達的價格為120萬元/針和129萬元/針。CAR-T價格高昂主要是由針對患者的個性化定制帶來的極高生產成本導致。

       根據發(fā)表在《international journal of cancer》的文獻報道，生產單人份CAR-T細胞成本約為8萬美元。在CAR-T的整個生產流程中，占用成本最多的是培養(yǎng)及轉導CAR-T所用的培養(yǎng)液、質粒、核酶、病毒載體等耗材，占用了成本的約49~51%，具體金額在5萬美元/針左右。CAR-T的生產與化學成分生產與控制（CMC）水平相關，以激活所使用的CD3/CD28beads為例，一管約在8萬元，制備一份CAR-T細胞需使用1/4~1/3，若CMC要求高，則剩余的beads都不能再使用，這也將造成成本的增加。所用病毒載體的GMP生產約占總成本的30%，當對病毒載體的需求量增大時，可降低CAR-T細胞制備的生產成本，以葛蘭素史克的慢病毒載體生產為例，生產100劑CAR-T慢病毒載體時，成本約為2.5萬美元/劑，生產1000劑時，成本約為4000美元/劑；生產10000劑時，成本約為1500美元/劑。其次是質控過程測量CAR-T產品無菌水平、細胞存活、CAR表達水平等所需的耗材，占用總成本的24~25%，具體金額約為2.5萬美元/針。目前影響CAR-T生產成本最大的兩項因素是產能利用率和病毒載體，提升生產規(guī)模和降低基因轉導載體的成本是降低CAR-T成本最有效的方式。

       圖6 CAR-T生產成本分析（Kymriah為例）

       總之：CAR-T治療復雜的工藝以及針對患者的個性化定制是導致成本高昂的主要原因，限制了產品臨床試驗的推進和可及性。但是CAR-T細胞療法治療在臨床應用的開展至今不過短短十幾年時間，隨著CAR-T細胞結構的逐步改進和完善，開發(fā)同種異體CAR-T已經成為該療法下一步的發(fā)展方向。通用型CAR-T(UCAR-T)可實現生產流程的規(guī)?；蜆藴驶?，可將生產成本降低90%，也期待著CAR-T治療成本降低來惠及更多患者。