從藥物發(fā)現看動力學評估

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作者：newborn 來源：新浪醫(yī)藥新聞

2022-02-21

藥物發(fā)現既昂貴又耗時。盡管在研發(fā)方面投入了大量資金，但自20世紀90年代以來，美國食品和藥物管理局（FDA）批準的平均藥物數量一直在下降。目前，每個被批準的新分子實體的研發(fā)成本約為18億美元，再加上專利到期，使制藥公司面臨著艱巨的任務——開發(fā)更多的產品以維持其創(chuàng)新。

決定藥物發(fā)現成功的重要因素之一是體內藥物動力學。這是指藥物與其靶點的結合動力學，包括結合和解離時間，這會影響藥物在體內的停留時間。隨著制藥公司更多地關注于優(yōu)化靶點結合親和力和選擇性，藥物動力學往往不被重視，盡管越來越多的證據表明動力學參數與藥物療效的相關性可能比親和力參數更強。在此，本文將討論用于研究藥物動力學的實驗和建模方法，以及如何利用它們來提高藥物發(fā)現的成功率。

01 動力學的重要性

藥物發(fā)現通常是通過在恒定藥物濃度下通過一系列體外實驗來識別和優(yōu)化先導化合物。這些實驗產生均衡量化指標，包括半數抑制濃度（IC50）和平衡解離常數（KD），用于預測藥物活性。

然而，當藥物進入人體時，由于胃腸道吸收、腎臟排泄和代謝等生理過程，它們的濃度會不斷變化。因此，越來越多的人認識到，基于均衡（equilibrium）的模型來評估藥物-靶點相互作用，對體內藥理學的預測性較差，而能夠捕捉藥物動力學的模型更適用于描述體內非均衡情況下的動態(tài)藥物-靶點相互作用。

02 結合及解離速率

表征動態(tài)藥物相互作用的2個最基本的單位是結合速率常數（association rate constant/on-rate，kon）和解離速率常數（dissociation rate constant/off-rate，koff）。當一起使用時，這些參數可以洞察藥物-靶點復合物的分子識別和穩(wěn)定性。研究表明，藥物停留時間（RT=1/koff是藥物療效和選擇性的關鍵預測因子，因為停留時間較長的藥物能夠通過減少靶點占有率的下降而產生更持久的作用，靶點占有率用于描述配體分子對靶點占據的程度。

雖然關于koff和如何減少koff的研究已經很多，但關于koff及其對體內靶點占有率的影響的數據相對較少。有趣的是，Zhou與其同事們（doi:10.1002/psp4.12035）發(fā)現，與流行的觀念相反，增加kon可以延長靶點占有時間。這一發(fā)現表明了優(yōu)化kon和koff的重要性。

IJzerman和Guo認為，對kon的研究不那么重視的一個原因是對度量的普遍假設存在疑問。20世紀90年代初，Smoluchowski開發(fā)了一種數學方法來建模生物分子反應，例如受體和配體之間的分子反應。該模型適用于各向同性、非相互作用的球體，其中kon僅取決于分子的大小及其溶劑的粘度，即擴散受限。然而，當涉及到具有立體特異性的藥物-靶點相互作用的建模時，假設kon不變且擴散受限就不再有用了。例如，如果一個配體只能在特定的位置和方向上與其受體結合，kon就會顯著下降。另一方面，有利的靜電吸引可以顯著增加kon。

03 實驗工具

據了解，有多種技術可以測量kon和koff，最古老的方法之一是放射配體結合分析法，但它存在一些局限性，例如難以將**標記配體與游離配體分離。這種分析法也忽略了由于配體結合而在受體中可能發(fā)生的構象變化，G蛋白偶聯受體就是這樣一個例子。

一種流行的、無標記的方法是表面等離子體共振（SPR），其中藥物-靶點復合物的形成會導致偏振光的折射率變化。它的優(yōu)點是試劑和樣品消耗量低，不需要標記，可以實時提供數據。SPR可用于測量各種分子之間的生物分子相互作用，包括蛋白質、離子和片段。然而，由于配體是分批測量的，通量仍然很低。此外，研究膜結合蛋白可能是一個挑戰(zhàn)，因為偏離天然構象的蛋白質可能與其靶點具有不同的相互作用。此外，蛋白質需要穩(wěn)定地結合到等離子體芯片上，這可能會限制這種方法的適用性。

可以說，目前使用最廣泛的技術是熒光共振能量轉移（FRET）和生物發(fā)光共振能量轉移（BRET），因為它們具有高靈敏度、與活細胞狀態(tài)的相容性，并且能夠通過商業(yè)設計熒光探針用于多種蛋白質。

這2種方法的機理相似，依賴于能量從供體分子到受體分子的距離依賴性轉移。為了使FRET和BRET能夠很好地工作，供體和受體分子必須非常接近（分別為10–100Å和10nm）。在FRET中，分子之間也必須有光譜重疊。與FRET不同，BRET不需要外部光源來激發(fā)供體分子。因此，它具有非常低的干擾背景信號，例如與FRET相關的自發(fā)熒光、光散射和光漂白。

其他新興的方法包括石英晶體微天平，它可以檢測由于配體與細胞結合而引起的質量變化，以及熒光相關光譜術，它可以測量粒子熒光強度的波動，其中自由配體可以與緩慢擴散的受體結合配體區(qū)分開來，而無需物理分離。等溫滴定量熱法（ICT）可實時測量生化反應引起的熱變化，并可直接讀出酶活性對抑制劑結合的響應。例如，熱信號的變化速率與抑制劑與酶的結合速率相關，這使我們能夠計算結合速率常數。雖然ICT在藥物動力學方面的應用受到限制（大部分應用是在熱力學方面），但該技術已被用于確定共價和非共價抑制劑與脯氨酰寡肽酶（POP）的結合動力學參數，后者是治療癌癥和神經退行性疾病的一個有希望的靶點。

對藥物動力學的日益重視導致了由歐洲創(chuàng)新藥物計劃（Innovative Medicines Initiative，IMI）與大型制藥公司共同資助的K4DD（Kinetics for Drug Discovery，藥物發(fā)現動力學）項目的誕生。該項目的一個主要發(fā)現是結合和解離速率常數受配體結構的強烈影響。讀者可以參考ChEMBl數據庫（https://www.ebi.ac.uk/chembl/）了解生物活性化合物的結構=動力學關系。

04 計算建模工具

隨著X射線晶體學和電子顯微鏡的進步，對藥物-靶點相互作用動力學的分子理解有所提高。利用所得數據，研究人員開發(fā)了計算模型，以了解定量結構動力學關系（QSKR）。這些模型通常使用統計機器學習來獲得藥物-靶點復合物的結構信息或者使用增強采樣的分子動力學模擬來建立。研究人員還將人工智能與分子模擬相結合，例如，Ribeiro等人利用神經網絡從無偏分子動力學中學習，然后創(chuàng)建了一個新框架來研究苯與溶菌酶的解離，這是一種十分受歡迎的常被研究的配體-蛋白質復合物。

例如，苯的離解會在溶菌酶中形成一個空腔，從而影響蛋白質的性質，如變性溫度和與特定配體的結合。這為優(yōu)化蛋白質工程創(chuàng)造了機會。Decherchi和Cavalli寫了一篇綜述，總結了分子模擬和取樣方法的進展。在他們的工作中，他們解釋稱，由于配體-蛋白質結合和解除結合的時間尺度范圍很廣，因此分子模擬捕捉大分子的實時動力學仍然具有挑戰(zhàn)性?？紤]到分子模擬中的時間步長為1飛秒，為了驗證毫秒或秒級的采樣事件，需要1012或1015個整合步驟，這超出了當前可用的計算技術。然后，作者總結了分子模擬對藥物動力學的貢獻，例如根據配體的藥物停留時間對其進行排序。

05 展望未來

人體是不斷變化的，因此捕捉動態(tài)藥物動力學是一項挑戰(zhàn)。這是復雜的，因為還有其他因素影響藥物動力學。例如，動力學選擇性，它指的是藥物結合選定靶點（chosen target）而非結合脫靶（off-target）的相對能力。該參數提供了對不想要的不利影響的洞察。動力學選擇性反過來又受到熱力學性質的影響，例如吉布斯能（Gibbs energy）和結合焓（enthalpy of binding），它們提供了驅動藥物-靶點相互作用的分子間作用力的根本信息。

進一步證實其重要性的是，動力學選擇性反過來會影響靶點易受攻擊性（target vulnerability），其定義為必須參與結合以引發(fā)所需響應的靶點比例。與高易受攻擊性靶點相比，低易受攻擊性靶點需要相對較高的藥物暴露水平，才能達到藥理學相關的靶點參與水平。這意味著，高易受攻擊性靶點受到動力學選擇性的強烈影響，因為產生一小部分活性靶點（例如靶點參與結合后通過藥物離解）需要更多時間。

雖然預測藥物動力學是復雜的，但隨著實驗和建模方法的不斷改進，有望做出更好的預測來提高藥物的療效和安全性。

參考資料：Andy Tay, PhD：Assessing Kinetics in Drug Discovery

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