雖然接種**是防控新冠疫情的最有效手段，但面對新的Omicron變異毒株，大多數(shù)**和中和抗體的保護(hù)效果明顯降低。開發(fā)新的廣譜抗病毒療法對于治療COVID-19仍具有重要意義。新冠病毒的RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）、PLpro（木瓜蛋白酶樣蛋白酶）、3CLpro蛋白酶（主蛋白酶Mpro）及解旋酶等病毒蛋白酶是主要的藥物靶點(diǎn)。默沙東與Ridgeback聯(lián)合開發(fā)的RdRp抑制劑Molnupiravir和輝瑞公司的主蛋白酶抑制劑Paxlovid（主要成分為PF-07321332及Ritonavir）均已通過FDA的緊急使用授權(quán)。今天我們通過來回顧Paxlovid的發(fā)現(xiàn)和研發(fā)過程。
SARS-CoV-2基因組編碼pp1a和pp1ab兩種多聚蛋白以及四種結(jié)構(gòu)蛋白。SARS-CoV-2的主蛋白酶可在11個(gè)不同位點(diǎn)切割多聚蛋白，產(chǎn)生對病毒復(fù)制至關(guān)重要的非結(jié)構(gòu)蛋白。冠狀病毒的主蛋白酶是一種具有三結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸蛋白酶，其特征是位于結(jié)構(gòu)域I和II之間具有Cys145-His41催化二聯(lián)體。主蛋白酶的底物共同特征是P1處存在Gln殘基，而已知的人類半胱氨酸蛋白酶均沒有在Gln后裂解，因而這為主蛋白酶作為抗病毒 藥物靶標(biāo)提供了潛在選擇性。鑒于病毒蛋白酶小分子口服抑制劑在HIV和HCV治療中取得的成功，以及SARS-CoV-2主蛋白酶在病毒復(fù)制中的關(guān)鍵作用，主蛋白酶Mpro成為RdRp之外另一個(gè)研究熱點(diǎn)。靶向主蛋白酶的藥物開發(fā)主要集中在底物位點(diǎn)、變構(gòu)位點(diǎn)和二聚化界面。
由于SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的主蛋白酶底物結(jié)合位點(diǎn)具有100%的序列同源性，輝瑞2002年針對暴發(fā)的SARS疫情發(fā)現(xiàn)的SARS-CoV-1主蛋白酶抑制劑PF-00835231（化合物1）對SARS-CoV-2主蛋白酶也具有很強(qiáng)的抑制活性，在細(xì)胞水平表型出較強(qiáng)的抗SARS-CoV-2病毒活性。
化合物1的透膜性和口服生物利用度較差，為了克服這一問題，研究人員嘗試減少P1’位的氫鍵供體，分別引入氰基和苯并噻唑-2-基酮兩種共價(jià)靶頭。引入氰基的化合物2在大鼠體內(nèi)口服吸收顯著提高，且保持了較好的代謝穩(wěn)定性，但體外對主蛋白酶的抑制作用及抗SARS-CoV-2病毒活性均降低。在P1’位引入苯并噻唑-2-基酮、P2位引入環(huán)狀亮氨酸擬肽類似物后得到化合物3可顯著提高透膜性，對主蛋白酶抑制作用降低主要是由于缺少了抑制劑與Gln189之間的氫鍵相互作用。為了更好地占據(jù)S3口袋，研究人員在P3位引入支鏈非環(huán)狀基團(tuán)。引入甲磺酰胺封端得到的化合物4伸向Gln189下方，增強(qiáng)與P3口袋殘基的結(jié)合，提高與Glu166骨架的氫鍵相互作用。與化合物3相比，化合物4對主蛋白酶的體外抑制活性，對SARS-CoV-2的抗病毒活性以及口服吸收均得到提高。對P3位封端進(jìn)行優(yōu)化，得到三****封端的化合物5，保持了對主蛋白酶的抑制作用，提高了抗SARS-CoV-2病毒活性、透膜性、代謝穩(wěn)定性和口服生物利用度。將P1’位換成氰基后得到化合物6（PF-07321332），對主蛋白酶的體外抑制活性進(jìn)一步提高，保持了抗SARS-CoV-2病毒活性和代謝穩(wěn)定性，提高了大鼠口服生物利用度。通過稀釋實(shí)驗(yàn)證明PF-07321332是SARS-CoV-2主蛋白酶的可逆性共價(jià)抑制劑。與化合物5相比，因PF-07321332更易于合成放大，且溶解性提高，易于制劑給藥，故作為臨床候選藥物開發(fā)。
PF-07321332對所有已知可感染人類的冠狀病毒的主蛋白酶均具有較強(qiáng)的體外抑制活性，而對哺乳動(dòng)物的半胱氨酸、絲氨酸和天冬氨酸蛋白酶沒有明顯抑制活性。PF-07321332在生理相關(guān)的A549和dNHBE細(xì)胞模型中也具有強(qiáng)大的抗病毒活性，在細(xì)胞病變實(shí)驗(yàn)（CPE）中對SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS及人冠狀病毒229E均具有強(qiáng)大的抗病毒活性。
在小鼠體內(nèi)，PF-07321332在300 mg/kg給藥劑量下血漿未結(jié)合藥物濃度即可長時(shí)間維持在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的EC90以上。在SARS-CoV-2小鼠模型中，PF-07321332可保護(hù)小鼠因感染病毒導(dǎo)致的體重降低，抑制病毒復(fù)制，顯著降低小鼠肺部病毒水平，降低肺部病理損傷。PF-07321332在大鼠和猴體內(nèi)靜脈給藥后的半衰期分別為5h和＜ 1h。在大鼠和猴體內(nèi)的2周重復(fù)給藥**實(shí)驗(yàn)中，PF-07321332的體內(nèi)暴露具有良好的劑量相關(guān)性，耐受性良好，未見明顯不良反應(yīng)。
由于CYP3A4是PF-07321332的主要代謝酶，而CYP3A4的強(qiáng)效抑制劑Ritonavir（RTV）在臨床上可作為多個(gè)經(jīng)CYP3A4代謝的蛋白酶抑制劑（如Darunavir、Lopinavir等）的藥代動(dòng)力學(xué)增強(qiáng)劑，因此，在健康成人受試者中進(jìn)行的隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照的單次劑量爬坡試驗(yàn)中，考察了PF-07321332單用、與RTV合用（Paxlovid）兩種方式，PF-07321332的安全性和耐受性良好，在與RTV合用后，口服血液濃度顯著提高，在給藥后12h，仍維持在體外抗SARS-CoV-2病毒EC90以上，因此，Paxlovid有望在臨床上取得強(qiáng)大的廣譜抗冠狀病毒活性。
綜上所述，PF-07321332可口服給藥，具有良好的選擇性和安全性，并可在小鼠模型中防止感染。在I期臨床試驗(yàn)中，該藥物達(dá)到了預(yù)期的抑制病毒作用濃度。因此，主蛋白酶抑制劑Paxlovid與RdRp抑制劑Molnupiravir、**聯(lián)合，有可能進(jìn)一步增強(qiáng)對新冠病毒疫情的防控。
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