2021年10月26日，國家藥典委員會官網(wǎng)發(fā)布《細胞類制品微生物檢查法》公示稿，公示期為三個月，彌補了國內(nèi)細胞類制品快速微生物替代方法領(lǐng)域的空白。
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0 1.
細胞類制品微生物檢查方法創(chuàng)新的必要性
近年來，細胞類制品（如明星產(chǎn)品-細胞治療產(chǎn)品）突飛猛進的發(fā)展，因其在臨床研究中取得的顯著療效而成為學術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界共同關(guān)注的焦點，在腫瘤領(lǐng)域（白血病、淋巴瘤等）治療中展現(xiàn)出顯著的治療效果而成為國內(nèi)外研究的熱點。
但該類制品在質(zhì)量屬性和無菌生產(chǎn)工藝上存在諸多特殊性，其個體差異大、產(chǎn)量少、效期短、臨床需求緊迫，終產(chǎn)品需要快速放行；加上作為無菌產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中，因細胞本身無法過濾除菌，無菌生產(chǎn)工藝要求更高，對過程控制要求也更高，無菌檢查試驗仍按現(xiàn)行版《中國藥典》中的無菌試驗方法對細菌、真菌檢查，這將不利于細胞類制品的研發(fā)和最終產(chǎn)品的無菌保證，中檢院、上海藥檢所等多名無菌檢測領(lǐng)域?qū)＜野l(fā)文呼吁國內(nèi)應(yīng)參考《歐洲藥典》“細胞產(chǎn)品的微生物控制”（Microbiological Examinationof Cell-based Preparations），盡快制訂中國特色的無菌檢查方法。
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0 2.
2020年版《中國藥典》微生物檢查方法用于細胞類制品局限性
現(xiàn)行版《中國藥典》（2020年版）傳統(tǒng)的無菌檢查方法存在局限性，表現(xiàn)在以下幾個方面：
(1) 檢測試驗時間長,效率低下，一個試驗周期至少需14天,不利于企業(yè)及早采取糾正措施,無法保證在產(chǎn)品使用前完成放行檢查。根據(jù)《細胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》（20171222）當細胞治療產(chǎn)品放行檢驗受到時間限制時，可考慮加強工藝過程中的樣品質(zhì)量監(jiān)控，將過程控制與放行檢驗相結(jié)合，通過過程控制簡化放行檢驗。
(2) 一些微生物在指定試驗條件下不易生長，即現(xiàn)行版《中國藥典》（2020年版）傳統(tǒng)的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件可能不適合一些微生物的生長，據(jù)報道有超過30%無菌檢查失敗發(fā)生在第7-14天。
(3) 細胞類制品樣品量少，使無菌檢查試驗檢測污染物的能力受到限制，污染程度越輕，出現(xiàn)錯誤結(jié)果的可能性越大。
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0 3.
中國特色的快速無菌檢查法規(guī)重點內(nèi)容搶先看
《細胞類制品微生物檢查法》為快速微生物檢查法，主要適用于效期短、批量小，采用現(xiàn)行無菌檢查法（通則1101）無法保證在產(chǎn)品使用前完成放行檢查的細胞類制品。
采用本法進行產(chǎn)品的微生物放行檢查，應(yīng)在充分考慮制品生產(chǎn)工藝、無菌保障水平、微生物污染風險、使用者獲益/風險等因素的基礎(chǔ)上，經(jīng)風險評估后有條件地施行?！都毎愔破肺⑸餀z查法》法系采用基于商品化全自動微生物培養(yǎng)系統(tǒng)檢測方法，通過儀器實時監(jiān)測微生物生長代謝產(chǎn)生的二氧化碳引起的培養(yǎng)瓶內(nèi)反應(yīng)底物的顯色或熒光變化信號，或培養(yǎng)瓶頂空壓力變化信號，結(jié)合目視觀察，判定供試品中有無微生物生長，重點內(nèi)容梳理如下：
1、培養(yǎng)基適用性檢查
此部分概括了商品化的儀器適配的培養(yǎng)基適用性檢查的確認條件。至少應(yīng)有2種適宜培養(yǎng)基用于檢測真菌、需氧細菌和厭氧細菌，包括無菌性檢查和靈敏度檢查。
1.1促生長試驗用微生物
檢測真菌、需氧細菌和厭氧細菌的培養(yǎng)基應(yīng)分別接種不大于100CFU的試驗菌，中國特色《細胞類制品微生物檢查法》沒有列舉培養(yǎng)基適用性檢查用微生物的種類，筆者摘錄了歐洲藥典，促生長試驗用微生物示例，供國內(nèi)研究者參考，示例如下圖：
1.2培養(yǎng)溫度
置于系統(tǒng)確認的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)，除另有規(guī)定外，接種細菌的培養(yǎng)基應(yīng)在3天內(nèi)生長良好，接種真菌的培養(yǎng)基應(yīng)在5天內(nèi)生長良好，中國特色《細胞類制品微生物檢查法》沒有列舉合理溫度設(shè)定的參數(shù)，筆者摘錄了歐洲藥典，自動化培養(yǎng)系統(tǒng)或自動化和人工結(jié)合試驗法的合理溫度設(shè)定示例，供國內(nèi)研究者參考，示例如下圖：
2、方法適用性試驗
應(yīng)至少采用2個批次的供試品進行方法適用性試驗，每批供試品應(yīng)至少平行進行3個重復(fù)的獨立實驗，方法適用性試驗示例如下表：
3、供試品的快速無菌檢查
3.1取樣
供試品應(yīng)能代表細胞產(chǎn)品的所有組分，并從成品中取樣。如成品取樣不適用，可采用替代取樣方案，如選取在處理細胞最后接觸的液體中取樣。采用本法進行生產(chǎn)過程的中間質(zhì)控時，應(yīng)從相應(yīng)質(zhì)控點取樣。
3.2供試品的最少檢驗量
對于單個容器且總體積（V）在1ml~1L的單一批次細胞制劑，供試品的最少檢驗量不應(yīng)低于下表；中間產(chǎn)品有多個容器時，每個容器應(yīng)分別取樣進行檢測。取樣后應(yīng)盡快將供試品接種至培養(yǎng)基，如供試品需存放，應(yīng)評估存放的潛在污染風險。
3.3培養(yǎng)及觀察
將供試品接種至培養(yǎng)基后盡快置于儀器中培養(yǎng)，禁止儲存。培養(yǎng)時間不少于7天，根據(jù)方法適用性試驗結(jié)果及特殊相關(guān)微生物的情況，可延長至14天。
3.4結(jié)果判斷
(1) 若儀器判定各供試品管均為陰性結(jié)果，且目視觀察未見渾濁，則供試品可判為符合規(guī)定。
(2) 若儀器判定有供試品管為陽性結(jié)果，且目視觀察發(fā)現(xiàn)渾濁，則供試品判為不符合規(guī)定。
(3) 若儀器判定供試品管為陰性結(jié)果，但目視觀察發(fā)現(xiàn)渾濁，或儀器判斷為陽性結(jié)果，但目視觀察未發(fā)現(xiàn)渾濁，出現(xiàn)以上兩種情況時，取該培養(yǎng)物不少于1ml轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，將原始培養(yǎng)物和新接種的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)不少于4天，觀察接種的同種培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片,染色,鏡檢,判斷是否有菌。如目視觀察發(fā)現(xiàn)渾濁或涂片發(fā)現(xiàn)有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。
上述任何一種情況下如判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗結(jié)果無效，即生長的微生物非供試品所含，可對供試品進行重試，重試時，應(yīng)重新取同量供試品，依法檢查，結(jié)果判定同上。
應(yīng)至少符合下列條件之一，判為試驗無效:
(1) 無菌檢查試驗所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求。
(2) 回顧無菌試驗過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。
(3) 在陰性對照中觀察到微生物生長。
(4) 供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當引起的。
專欄作者：滴水司南
生物醫(yī)藥高級工程師、執(zhí)業(yè)藥師，自媒體時代的藥政法規(guī)搬運工，堅定終身學習的目標，堅持學用結(jié)合，努力做到知行合一。
參考文獻
[1] 中國藥典委員會官網(wǎng)、歐洲藥典、中國藥品標準雜志等
[2] www.gcpunion.org
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