全面解析，一文搞懂脂質(zhì)體包封率

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       0 1.

       什么是脂質(zhì)體？

       1961年，Alec Douglas. Bangham和R.W.Horne用經(jīng)過負(fù)染的磷脂調(diào)試電子顯微鏡時，在電鏡下觀察到磷脂形成了類似細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)，并于1964年發(fā)表了他們拍攝的電鏡照片。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)磷脂分散在水中時會形成多層小囊泡，并且每一層均為脂質(zhì)雙分子層，各層之間被水相隔開。他們將這種內(nèi)部是一定量水完全由單層或多層同心（或非同心）磷脂雙分子層包裹的人工囊泡稱為脂質(zhì)體。由于脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)類似于生物膜，故又稱為人工生物膜。

       脂質(zhì)體的基本結(jié)構(gòu)和類型可分為單層脂質(zhì)體和多層脂質(zhì)體。含有單層雙分子層磷脂膜的囊泡成為單層脂質(zhì)體（ULV）即單室脂質(zhì)體。單室脂質(zhì)體又分為小單室脂質(zhì)體（SUV, 粒徑＜100nm）即納米脂質(zhì)體、大單室脂質(zhì)體（LUV, 粒徑＞100nm）和巨大大單室脂質(zhì)體（GUV, 粒徑＞1000nm）。含有多層雙分子層磷脂膜的囊泡稱為多層脂質(zhì)體（MLV, 粒徑100~1000nm）。含有多個單室脂質(zhì)體的囊泡稱為多室脂質(zhì)體（MVV, 粒徑＞1000nm）。

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       0 2.

       什么是脂質(zhì)體包封率？

       包封率是脂質(zhì)體的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，它指的是包封在脂質(zhì)雙分子層中的藥物含量占總投藥量的百分比，能反映出脂質(zhì)體中藥物包封程度的高低，以指導(dǎo)制備工藝的改進(jìn)。

       由于包封的藥物性質(zhì)不同，脂質(zhì)體膜材料不同，測定每種脂質(zhì)體包封率的最 佳方法往往需要經(jīng)實驗考察才能確定。包封率測定的關(guān)鍵是將包封藥物和未包封的游離藥物分離，再利用光譜、色譜等分析手段檢測包封藥物或游離藥物的濃度。常用的包封率測定方法有：離心法、超濾離心法、葡聚糖凝膠柱法、微柱離心法、透析與反透析法、魚精蛋白凝聚法、熒光法等。

       （一） 離心法

       按照離心轉(zhuǎn)速的不同，離心法分為低速離心法和超速離心法。低速離心法適用于脂溶性藥物，其工作原理是脂溶性的游離藥物不溶于溶解脂質(zhì)體所需的水相介質(zhì)，而懸浮在體系中，采用相 對較小的離心強度和較短的離心時間，這些未溶的游離藥物會因離心力的作用而沉降，但脂質(zhì)體仍存在于上清液中，從而實現(xiàn)分離。

       超速離心法要求離心轉(zhuǎn)速大于20 000 r／min，離心時間一般要長于30 min。離心過程中因空氣摩擦產(chǎn)熱，需使用控溫離心機。與低速離心法剛好相反，超速離心法中脂質(zhì)體最終存在于沉淀中。由于脂質(zhì)體和不溶的游離藥物會一起沉降下來，無法實現(xiàn)二者的分離，所以此法適用于水溶性較好的藥物的測定，可保證游離藥物仍存在于上清液中。此外應(yīng)注意較強的離心力作用可能會導(dǎo)致微粒聚集，破壞脂質(zhì)體雙分子層結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致藥物發(fā)生泄漏。

       （二） 超濾離心法

       超濾離心法是將脂質(zhì)體放入配有超濾膜的超濾管中，在適宜的轉(zhuǎn)速下離心，游離藥物在離心力的作用下可通過超濾膜，而脂質(zhì)體則被截留，從而實現(xiàn)二者的分離。超濾離心法多用于測定水溶性藥物脂質(zhì)體的包封率。

       然而“濃差極化”現(xiàn)象的存在限制了超濾法的應(yīng)用。濃差極化現(xiàn)象是由于在超濾過程中，溶劑和小分子溶質(zhì)能透過超濾膜，而大分子溶質(zhì)被截留在膜內(nèi)，這就會導(dǎo)致超濾膜表面的大分子溶質(zhì)濃度升高，引起膜附近的滲透壓增加，阻礙溶液繼續(xù)向超濾膜方向擴散，進(jìn)而降低了溶劑和小分子物質(zhì)的膜透過率。

       （三） 葡聚糖凝膠柱法

       葡聚糖顆粒在溶脹后可形成凝膠狀結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部具有一定大小的孔徑，小分子游離藥物可進(jìn)入孔內(nèi)，實現(xiàn)一定程度的保留；而脂質(zhì)體粒徑大于凝膠孔徑，脂質(zhì)體無法進(jìn)入孔內(nèi)，于是少量洗脫液便可將其洗脫下來。利用脂質(zhì)體和游離藥物在葡聚糖凝膠柱上保留能力的不同可實現(xiàn)二者的分離。

       （四） 微柱離心法

       相比葡聚糖凝膠柱法，微柱離心法加入的洗脫液體積大大減小，避免了脂質(zhì)體因稀釋作用而發(fā)生的泄漏。此法是將溶脹好的葡聚糖凝膠或經(jīng)預(yù)處理的離子交換樹脂裝入注射器中，反復(fù)平衡、離心后制成干燥的微柱，然后在其頂端加入脂質(zhì)體混懸液，靜置幾分鐘后再加入洗脫液，設(shè)置適宜的離心轉(zhuǎn)速將脂質(zhì)體洗脫下來。若凝膠對脂質(zhì)體有很強的吸附作用，則不能選用該法。實驗中應(yīng)注意離心轉(zhuǎn)速的選擇，轉(zhuǎn)速過大或過小都可能引起凝膠柱柱頭斷裂，且轉(zhuǎn)速過大會將游離藥物也洗脫下來。

       （五） 透析與反透析法

       透析法是將脂質(zhì)體放入截留一定分子量的透析袋內(nèi)，一般用水或PBS緩沖液作為透析介質(zhì)，游離藥物因透析袋內(nèi)外的濃度差而向透析介質(zhì)中轉(zhuǎn)移，而脂質(zhì)體因為粒徑較大則被截留在透析袋內(nèi)，二者因此實現(xiàn)分離。但脂溶性游離藥物在透析介質(zhì)中溶解度較差，會聚集在透析膜表面，堵塞膜上微孔而無法進(jìn)入透析外液。

       透析試驗中為了滿足漏槽條件，需要大量的透析介質(zhì)，這無疑會稀釋整個脂質(zhì)體系統(tǒng)，破壞脂質(zhì)體和周圍游離藥物的動態(tài)平衡，甚至導(dǎo)致脂質(zhì)體的泄漏，并且較長的透析時間也對脂質(zhì)體的穩(wěn)定性有很高的要求。反透析法可以避免上述問題的發(fā)生。它是將脂質(zhì)體放在透析袋外，透析袋內(nèi)裝入透析介質(zhì)。由于透析介質(zhì)用量大大減少，可有效避免脂質(zhì)體因為稀釋作用而發(fā)生的泄漏。

       （六） 其他方法

       魚精蛋白凝聚法：魚精蛋白是一種堿性蛋白質(zhì)，帶正電，它可與帶負(fù)電或中性的脂質(zhì)體結(jié)合形成聚合物，密度有所增加，離心后脂質(zhì)體-魚精蛋白聚合物被沉淀下來，因而與游離藥物實現(xiàn)分離。

       固相萃取法：利用色譜吸附原理，游離藥物被吸附在極性相近的SPE柱固定相上，而脂質(zhì)體在SPE 柱上無保留，少量水便可洗脫下來。固相萃取法對脂質(zhì)體和游離藥物的分離度較高，因為它是借助更特征的，更穩(wěn)定的吸附能力的差異實現(xiàn)分離。然而該法較為復(fù)雜，藥物與SPE柱固定相之間吸附作用的強弱受多種因素影響，需要進(jìn)行大量實驗才能摸索出最 佳的實驗條件。

       熒光法：目前使用的包封率測定方法大部分都需要先將脂質(zhì)體和游離藥物分離，而熒光法不需進(jìn)行分離，只要利用包封藥物和游離藥物不同的熒光特性，比較脂質(zhì)體破乳前后熒光強度的變化，便可計算出包封率。

       表1 幾種載藥脂質(zhì)體包封率測定方法對比

       備注：EPC:蛋黃卵磷脂;CHOL:膽固醇;DPPC:二棕櫚酰磷脂酰膽堿;DCP:鞘髓磷脂;GMS:單雙甘油脂肪酸酯;SPC:大豆卵磷脂;DDAB:雙十二烷基二甲基溴化銨;PEG2000:聚乙二醇2000;DSPE-PEG2000:二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000;PC:卵磷脂; DSPE-PEG2000-NHS:二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-N-羥基琥珀酰亞胺;DOTAP:(2,3-二油?；?丙基)-三甲胺;HSPC:氫化大豆卵磷脂;DOPE:二油酰磷脂酰乙醇胺

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       0 3.

       如何選用最合適的包封率測定方法呢？

       低速離心法適用于脂溶性藥物，操作簡單，且不易破壞脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)，但脂質(zhì)體和游離藥物常常不能完全分離；超速離心法多用于水溶性藥物，且要求脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)有一定的硬度，能夠耐受高轉(zhuǎn)速的影響。超濾離心法適用范圍較廣，超濾膜的材料和截留分子量有多種類型，可滿足試驗者的多重需要；其缺點是可能會出現(xiàn)濃差極化現(xiàn)象，在一定程度上稀釋脂質(zhì)體待測溶液可以避免該現(xiàn)象的發(fā)生。葡聚糖凝膠柱法和微柱離心法均是利用分子排阻的原理來分離，但如果藥物在凝膠柱上無保留或吸附過強，則不能采用這兩種方法。葡聚糖凝膠柱法由于大量洗脫液的加入稀釋了脂質(zhì)體系統(tǒng)，可能會導(dǎo)致脂質(zhì)體泄漏。但是微柱離心法的柱體積小，加入洗脫液的體積也少，不會引起脂質(zhì)體泄漏，但是需要考察離心轉(zhuǎn)速，以獲得最 佳的分離效果。透析法也是測定包封率的常用手段，適用于水溶性藥物，但是透析時間一般長達(dá)36 h以上，對脂質(zhì)體穩(wěn)定性有較高要求；此外大量透析介質(zhì)的加入同樣會稀釋脂質(zhì)體系統(tǒng)，也可能導(dǎo)致脂質(zhì)體泄漏。反透析法極大地減少了透析介質(zhì)的用量，較好地避免了因稀釋作用而發(fā)生的脂質(zhì)體泄漏。魚精蛋白凝聚法只適用于帶負(fù)電及中性的脂質(zhì)體，而固相萃取法雖然在分離脂質(zhì)體和游離藥物方面有不錯的效果，但是實驗方法復(fù)雜，不易摸索出最 佳分離條件。熒光法可在脂質(zhì)體和游離藥物共存的狀態(tài)下測定包封率，不要求把二者分離，但一般均需要引入熒光指示劑，發(fā)生某種熒光反應(yīng)來計算包封率。

       根據(jù)待測物的性質(zhì)和各種測定方法的特點，總結(jié)出脂質(zhì)體包封率測定方法選擇決策樹，見圖1。

       圖1 脂質(zhì)體包封率測定方法選擇決策樹

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       0 4.

       影響脂質(zhì)體包封率的因素有哪些？

       影響脂質(zhì)體包封率的因素有很多，包括脂質(zhì)膜的組成、磷脂鏈長、電荷、粒徑大小、制備方法、藥物的性質(zhì)等，選擇其中合適的一項或者幾項進(jìn)行改進(jìn)，能改善或提高脂質(zhì)體的包封率。

       脂質(zhì)膜組成和脂質(zhì)體電位

       脂質(zhì)雙層膜的組成影響著藥物在膜內(nèi)的分配和包封率。脂質(zhì)體由大豆或蛋黃中提取的磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）或其氫化衍生物制備而成。天然磷脂上含有不飽和脂肪酰鏈，而它們易氧化分解，影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

       藥物性質(zhì)

       藥物自身的溶解度、極性和雙分子層的匹配程度等因素均會對包封率產(chǎn)生影響。具有高親脂性或高親水性的藥物，即lgPoct 在4.5~-0.3 的藥物能形成包封率較高的脂質(zhì)體。所以可以考慮將藥物成鹽或者酯化再形成脂質(zhì)體，以提高脂質(zhì)體的包封率或穩(wěn)定性。

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       0 5.

       包封率如何計算？

       《中國藥典》2005年版（二部）附錄“微囊、微球及脂質(zhì)體制劑指導(dǎo)原則”中質(zhì)量檢查項目下規(guī)定：若得到的是分散在液體介質(zhì)中的微囊、微球、脂質(zhì)體，應(yīng)通過適當(dāng)?shù)姆椒ǎㄈ缒z色譜柱法、離心法或透析法）進(jìn)行分離后測定，按下式計算包封率。

       包封率（%）=系統(tǒng)中包封的藥量/系統(tǒng)中包封與未包封的總藥量×100%

       包封率不得小于80%。

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       0 6.

       展望

       現(xiàn)有的包封率測定方法基本上都是利用脂質(zhì)體和游離藥物在粒徑尺寸方面的差異先將二者分離，再準(zhǔn)確測定某一方的濃度。但是這種物理差異專屬性不強且不穩(wěn)定，易受影響和干擾。未來包封率測定方法應(yīng)該更多地結(jié)合光譜、色譜等手段，以增加方法的專屬性和可靠性，還可利用脂質(zhì)體和游離藥物在物理、化學(xué)性質(zhì)方面其他的不同點，開發(fā)出具有不同工作原理的新方法，并且各種方法之間可以相互印證，使測定結(jié)果更可靠。