共價結(jié)合藥物的設(shè)計與開發(fā)

       前言

       長久以來，親電性基團是藥物開發(fā)中的雷區(qū)，因而在以往經(jīng)典的藥物化學(xué)教材中，總會建議避免在藥物分子結(jié)構(gòu)中引入此類官能團，如環(huán)氧、吖啶、Michael受體等，因為其具有的高反應(yīng)性，可能會與多種生物大分子相互作用，引起嚴(yán)重的毒副作用。

       早前的阿司匹林、蘭索拉唑、氯吡格雷等在近年來的研究中發(fā)現(xiàn)，均以共價鍵形式與靶點作用。受此啟發(fā)，共價型藥物的開發(fā)慢慢進入人們的視野，在抗癌、抗病毒、糖尿病等多個領(lǐng)域內(nèi)顯現(xiàn)出了非共價結(jié)合藥物難以匹及的優(yōu)勢，如療效更為持久、治療劑量更低等、不易產(chǎn)生耐藥性等。

       由于共價結(jié)合和非共價結(jié)合的作用機制不同，因而在研發(fā)過程采用傳統(tǒng)的評價指標(biāo)，如解離常數(shù)、IC50、EC50等，難以真正體現(xiàn)其效能與安全性，這主要是因為藥物分子與靶點形成共價鍵受反應(yīng)速率的影響，而非共價結(jié)合作用則僅是一個熱力學(xué)平衡過程，在短時間內(nèi)就能顯現(xiàn)出化合物的活性，采用傳統(tǒng)的評價指標(biāo)往往會造成誤判。

       共價結(jié)合藥物和天然產(chǎn)物

       從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新的藥物是新藥開發(fā)項目中常見的策略，而且有很多藥物都是基于這一方式發(fā)現(xiàn)的，如紫杉醇、喜樹堿、嗎 啡等，另外一種方式則是對天然產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)修飾，得到效果更佳的化合物，如從水楊酸到阿司匹林，從嗎 啡到美沙 酮，據(jù)統(tǒng)計，臨床上約占60%的藥物都是基于上述策略得到的。

       雖然共價結(jié)合藥物是近幾年才熱門起來，在自然界中，這一概念卻并不罕見，青霉素、焦土霉素、磷霉素等一些抗生素都是以共價鍵的形式與細(xì)菌中的目標(biāo)靶點相互作用。利普斯他汀是一種從鏈霉菌中分離出來的胰脂酶不可逆抑制劑，基于此天然產(chǎn)物，Roche開發(fā)出新型減肥藥奧利司他，諸如此類的例子還有很多。

       以上諸多天然產(chǎn)物的實例證明，共價結(jié)合作用是藥物設(shè)計中被忽視的寶地！藥物靶點大多數(shù)都是蛋白質(zhì)，其中絲氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、組氨酸等殘基中含有親核活性官能團(羥基、巰基、氨基等)，因而，蛋白質(zhì)可以作為一個優(yōu)良的親核體，可以與具有親電活性的基團發(fā)生作用，形成共價鍵。對于此類化合物的設(shè)計，最大的難點在于選擇性，否則容易引起嚴(yán)重的副反應(yīng)，造成開發(fā)失敗。

       目前，約30%以酶為靶點的藥物采用共價結(jié)合形式，主要是因為這一設(shè)計理念是近幾年才被接受，在此之前，活性反應(yīng)基團是藥物設(shè)計中盡可能避免的結(jié)構(gòu)。特拉匹韋由Merck開發(fā)，在2011年獲得FDA上市許可，通過與HCV蛋白酶中具有催化作用的絲氨酸殘基(羥基)形成半縮醛，抑制其活性，從而實現(xiàn)抗病毒作用。最初該化合物在標(biāo)準(zhǔn)的IC50測試中，活性很差，幾近放棄，然而在特別設(shè)計的活性測試中，則表現(xiàn)優(yōu)異，特拉匹韋的研發(fā)歷程深刻體現(xiàn)了在共價結(jié)合藥物的研發(fā)中，需要一套與傳統(tǒng)非共價結(jié)合藥物開發(fā)不同的評價方法。

       另外一個比較經(jīng)典的例子是EGFR受體不可逆抑制劑阿法替尼的開發(fā)(2013年上市)，其結(jié)構(gòu)中的親電活性基團丙烯酰胺與EGFR受體活性位點中的半胱氨酸殘基(巰基)形成共價鍵，克服了第一代EGFR(吉非替尼、厄洛替尼等)受體抑制劑出現(xiàn)的耐藥性問題，同時對非耐藥性EGFR受體也表現(xiàn)出良好的活性。以上兩個成功的例子證明了共價結(jié)合藥物具有的潛力，另一方面，其研發(fā)過程也為共價結(jié)合藥物的發(fā)展提供了寶貴的經(jīng)驗！

       藥物—靶點結(jié)合歷程

       與非共價結(jié)合藥物相同的是，共價結(jié)合藥物首先與靶點相互作用，形成藥物-靶點結(jié)合物，由于此歷程屬于熱力學(xué)過程，因而能夠很快的達到平衡，其親和力可以用解離常數(shù)Ki或者IC50等參數(shù)進行描述。不同之處在于，第二步共價鍵的形成，與第一步相比，共價鍵的形成速率相對較慢，且存在一個反應(yīng)平衡常數(shù)Ki*，因而，共價結(jié)合物藥物的總體結(jié)合情況需要考慮兩個參數(shù)：Ki以及Ki*。當(dāng)krea遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于krev-rea時，反應(yīng)平衡常數(shù)趨向無窮大，可視為不可逆共價結(jié)合，當(dāng)krea與krev-rea相差并不是很大，即Ki*在一個合理的數(shù)值范圍內(nèi)，可視為可逆共價結(jié)合。

       結(jié)合機理

       藥物靶點大多數(shù)都是蛋白質(zhì)，由于其結(jié)構(gòu)中富含羥基、巰基、氨基等官能團，因而本質(zhì)上可以作為親核試劑，共價結(jié)合化合物通常在結(jié)構(gòu)中含有親電性官能團，如Michael受體，環(huán)氧、鹵素、羰基、異氰等結(jié)構(gòu)，可作為親電體，兩者相互反應(yīng)形成新的共價鍵，其涉及到的反應(yīng)類型主要有以下幾種：?；磻?yīng)、烷基化反應(yīng)、Michael加成、二硫鍵化、Pinner反應(yīng)等，采用哪種共價鍵形成方式，取決于靶點結(jié)合位點的性質(zhì)，總的來說，可以選擇的余地較大。

       2014年，美國十大暢銷藥中，其中之一為埃索美拉唑(消旋體為奧美拉唑)。奧美拉唑在1970年代被開發(fā)出來，經(jīng)過若干優(yōu)化和臨床研究后，于1988年上市，兩年后才發(fā)現(xiàn)其質(zhì)子泵抑制作用是基于共價鍵形式的，奧美拉唑在靶點附近經(jīng)在酸性條件下活化，形成活性亞磺酰胺衍生物活性產(chǎn)物，然后與靶點中的半胱氨酸殘基(巰基)形成共價鍵，抑制胃酸的分泌。

       另一個暢銷共價藥便是氯吡格雷，它需要在肝 臟內(nèi)經(jīng)P450氧化酶活化，生成含硫化合物，然后與P2Y12受體中的半胱氨酸殘基形成二硫鍵，抑制血小板凝聚。上述兩個藥物目前應(yīng)用非常廣泛，而且在最初設(shè)計的時候并不是以共價鍵作用形式，只是在后來的機理研究中發(fā)現(xiàn)，是以共價鍵作用與靶點結(jié)合，產(chǎn)生不可逆的抑制作用。

       含有氰基的化合物，通常在與蛋白中的親核性官能團如羥基、巰基發(fā)生Pinner反應(yīng)，形成亞胺酯鍵，通常該類共價鍵是可逆的，比較成功的例子如DPP4抑制劑沙格列汀和維格列汀等，用于II型糖尿病的治療。除此之外還有奧當(dāng)卡替，用于絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的治療，但由于其潛在的中風(fēng)風(fēng)險，2016年Merck宣布放棄該化合物。

       至于其他的幾種共價結(jié)合機理，如烷基化、?；?、Michael加成等，在此不一一列舉，其本質(zhì)都是生物大分子中的親核性基團與藥物分子中的親電基團進行相互作用。

       選擇性的控制

       共價結(jié)合藥物的選擇性至關(guān)重要！在選擇性的問題上，目前比較常見的策略是，首先設(shè)計對目標(biāo)靶點具有高度選擇性非共價結(jié)合作用先導(dǎo)物，然后在此化合物的基礎(chǔ)上，進行活性反應(yīng)官能團的優(yōu)化設(shè)計，即先找到合適的“彈殼”，然后再加裝合適的“彈頭”。

       比較典型的例子如奧西替尼的開發(fā)，最初得到的先導(dǎo)化合物1在體外靶點結(jié)合實驗表現(xiàn)出了優(yōu)異的結(jié)合性，但是在細(xì)胞實驗中其親和性驟降了近70倍之多，可能是因為細(xì)胞中高濃度ATP與其競爭性的靶點結(jié)合所導(dǎo)致的，因而采用不可逆的共價結(jié)合作用策略，成功開發(fā)出第三代肺癌靶向藥奧西替尼，該藥于2017年獲得FDA和歐盟的上市許可，同年獲得CFDA的上市許可。

       除上述提及的策略外，還可以通過人體不同組織的理化特性實現(xiàn)選擇性，如奧美拉唑，由于其需要在強酸性條件下才能活化，因而可以選擇性的作用于質(zhì)子泵。

       另外，通過精心設(shè)計的親電性基團也能實現(xiàn)選擇性。α-氰基取代丙烯酰胺與巰基的Michael加成為可逆過程，在特定的靶點中，由于其他氨基酸殘基的非共價作用，可以穩(wěn)定該加成產(chǎn)物，而其他非目標(biāo)靶點不能實現(xiàn)該效應(yīng)，從而實現(xiàn)選擇性，當(dāng)然該策略需要有非常強的生物信息學(xué)支撐，否則難以實現(xiàn)。

       **問題

       雖然共價結(jié)合藥物設(shè)計策略目前日趨成熟，但其風(fēng)險仍然不容小覷，尤其是不可逆的共價結(jié)合作用。由于小分子化合物與靶點形成新的共價鍵，因而會導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的變化，存在免疫反應(yīng)的可能性，但此類報道較為罕見。脫靶效應(yīng)也是引起**的重要原因，針對此問題，提高化合物的選擇性以及較低的治療劑量是行之有效的解決方案。

       小結(jié)

       目前大多數(shù)的共價結(jié)合藥物集中在抗癌領(lǐng)域，但是隨著技術(shù)和理論的日趨成熟，此類藥物將在越來越多的疾病領(lǐng)域大顯身手。

       參考資料

       1、Cesco, Stephane De, et al. "Covalent inhibitors design and discovery." European Journal of Medicinal Chemistry 138(2017):96-114.

       2、Rand M. Miller, Ville O. Paavilainen, Shyam Krishnan, Iana M. Serafimova, Jack Taunton. "Electrophilic Fragment-Based Design of Reversible Covalent Kinase Inhibitors." Journal of the American Chemical Society 135.14(2013):5298.

       3、Baillie, Thomas A. "Targeted Covalent Inhibitors for Drug Design." Angewandte Chemie International Edition 55.43(2016):13408-13421.

       4、Lagoutte, R, R. Patouret, and N. Winssinger."Covalent inhibitors: an opportunity for rational target selectivity." Current Opinion in Chemical Biology 39(2017):54-63.

       5、Ward, R. A., et al. "Structure- andreactivity-based development of covalent inhibitors of the activating andgatekeeper mutant forms of the epidermal growth factor receptor (EGFR)." Journal of Medicinal Chemistry 56.17(2017):7025-48.