TREG療法:通向腎 器官移植領(lǐng)域圣杯的希望？

       如何提高移植物和移植受者的長期存活率是移植學研究的主題，其中，對于免疫抑制劑的研究占據(jù)著重要的地位，而免疫抑制劑一面是其抗排斥反應(yīng)療效，另一面則是其不良反應(yīng)。免疫抑制劑能抑制與免疫反應(yīng)相關(guān)細胞（主要是T細胞和B細胞）的增殖和功能，降低免疫應(yīng)答。由于各種免疫抑制劑的作用機制不同且其不良反應(yīng)的程度多與使用劑量有關(guān)，因此，針對移植排斥反應(yīng)發(fā)生的不同靶點和關(guān)鍵步驟常采用多種免疫抑制劑聯(lián)合的方案，這樣既可協(xié)同增強免疫抑制效果，又可降低各種免疫抑制劑的劑量和不良反應(yīng)的發(fā)生率。

       APC 為抗原提呈細胞；IL為白細胞介素；TCR為T細胞受體；JAK為Janus激酶；PI3K為磷脂酰肌醇-3-激酶；mTOR為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；CN為鈣調(diào)磷酸酶；MAP激酶為有絲分裂原活化蛋白激酶；IKK為核因子-κB激酶抑制劑；NFAT為活化T細胞核因子；AP-1為激活蛋白因子；CKD/cyclins 為周期蛋白依賴激酶；IMPDH為次黃嘌呤核苷酸脫氫酶。

       近十年來，Treg細胞療法在一系列與移植相關(guān)和非移植相關(guān)的適應(yīng)癥上進行了臨床試驗。雖然這些試驗都集中在安全性上，但所有試驗的一個核心主題是GMP方案在細胞分離、操作、擴增、劑量、特異性和給藥后細胞跟蹤方面的異質(zhì)性。目前Treg在標準化方面達成了一些共識，但現(xiàn)實是Treg細胞的新穎性要求進行大量的人體研究和專注于GMP條件的優(yōu)化和標準化。部分研究更多的想要制造更純的細胞，這種想法基于供體反應(yīng)特異性TREG比多克隆TREG能更好的治療移植效應(yīng)T細胞反應(yīng)。在人類中闡明和利用這一機制是很重要的，因為產(chǎn)物純度和同種異體抗原特異性的程度可能會對治療效果和輸注細胞數(shù)量產(chǎn)生影響。腎 臟的一個關(guān)鍵優(yōu)勢是活體供者有更大的后勤保障范圍，這就提供了連續(xù)獲取新鮮供者抗原的途徑，從而提供了供者特異性的Treg細胞。

       01、Treg分類

       由于慢性同種異體移植功能障礙和免疫抑制的長期副作用尚未完全解決，移植耐受仍然是器官移植領(lǐng)域的圣杯。在這一點上，外周循環(huán)和移植物微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)的增加被認為是誘導(dǎo)移植物耐受的重要因素。

       人和鼠的多克隆Treg細胞被經(jīng)典地分為胸腺Treg細胞(tTreg)、外周Treg細胞(pTreg)和誘導(dǎo)型Treg細胞(iTreg)三大類，一些學者通過tTreg細胞上Helios和Neuropilin-1(NRP-1)的高表達來區(qū)分tTreg細胞和pTreg細胞。然而，Helios/NRP-1本身不能對人類的tTregs和pTreg細胞進行分類。

       外周循環(huán)中Treg細胞的特征是CD4+，高水平的IL-2受體α鏈(CD25high)，低水平的CD127和細胞內(nèi)表達叉頭盒P3轉(zhuǎn)錄因子(FOXP3+)。新的深層免疫表型技術(shù)的采用證實了這種表型比最初認為的更具異質(zhì)性，這些數(shù)據(jù)因Treg細胞的種類、類型、分化狀態(tài)和微環(huán)境的不同而不同。進一步的區(qū)分是通過鑒定趨化因子受體。

       02、目前研究報道的Treg細胞的特別性質(zhì)

       A:Treg細胞的可塑性

       Treg細胞在炎性微環(huán)境中采用Th17樣效應(yīng)細胞表型和功能的可能性是一個關(guān)鍵的安全問題。這是因為Th17細胞在急性和慢性同種異體移植排斥反應(yīng)患者中升高，因此可能導(dǎo)致這兩種情況的惡化。另一種與Treg-Th17相互作用有關(guān)的途徑是，兩者最初都起源于Naive CD4+細胞，但其隨后的分化途徑分別由微環(huán)境中不含IL-6的轉(zhuǎn)化生長因子-β(針對Treg)或與IL-6(針對Th17)的存在所決定。微環(huán)境將Treg細胞轉(zhuǎn)化為促進排斥反應(yīng)的Th17細胞的潛力可能決定了輸注Treg細胞的時間點。理論上，Treg細胞治療可以是主動的(即在患者發(fā)生排斥反應(yīng)之前)，也可以是反應(yīng)性的(即給予診斷為急性或慢性排斥的患者)。然而，目前尚不清楚Treg細胞能否在已經(jīng)被Teffs滲透的微環(huán)境中誘導(dǎo)耐受。

       B: 旁觀者壓制效應(yīng)

       Treg細胞治療可能會出現(xiàn)一個潛在的問題，因為Treg細胞一旦被激活，就可以以一種非抗原特異性的方式執(zhí)行它們的抑制功能。這種被稱為“旁觀者抑制”的效應(yīng)是在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)的，在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，抗原特異性的CD4+CD25+T細胞最初需要與TCR介導(dǎo)的互補表位接觸才能激活。然而，一旦激活，這些細胞也能夠抑制第三方抗原特異性的效應(yīng)CD4+T細胞。這一效應(yīng)在同種異體皮膚移植的小鼠體內(nèi)模型中也得到了證實。如果這一現(xiàn)象確實在我們的患者中重復(fù)出現(xiàn)，可能會對調(diào)節(jié)抗原特異性排斥反應(yīng)，同時保持對病原體和潛在腫瘤新表位的免疫力產(chǎn)生影響。

       03、TREG代表性試驗

       A. TRACT試驗

       試驗招募9人，細胞分離采用Clinimacs系統(tǒng)，3周擴增過程中采用抗CD3/CD28拮抗劑、IL-2、TGF-β、西羅莫司。最后得到純度>98% CD4+CD25+和>80% FOXP3+以及相似的去甲基化水平?；颊咴谝浦伯斕旌托g(shù)后第2天接受alemtuzumab治療，并維持使用MMF和他克莫司(第30天改用西羅莫司)。Treg細胞隨后在第60天被輸注。在報告的兩年中，沒有巨細胞病毒或多瘤病毒引起的機會性感染病例，也沒有發(fā)生排斥反應(yīng)。這項試驗沒有報道在接受新腎移植的患者輸注多克隆Treg細胞后發(fā)生機會性感染或排斥反應(yīng)的病例。

       B. TASK試驗

       相比之下，TASK試驗集中在利用多克隆Treg細胞來調(diào)節(jié)移植腎的亞臨床炎癥。這是一個重要的研究問題，因為亞臨床炎癥由于其慢性低級別的性質(zhì)而沒有得到及時的診斷，并可能導(dǎo)致遲發(fā)性同種異體移植物功能障礙。

       患者接受體外擴增的自體Treg細胞，平均劑量為320*106個細胞。2周擴增：抗CD3/CD28拮抗劑，IL-2，重氫葡萄糖處理。最終得到純度>97%CD4+和>93% FOXP3+和<0.37% CD8+的產(chǎn)品。

       試驗招募了三名患者，他們在移植后6個月的活組織檢查中表現(xiàn)出這種炎癥(Banff i-和t-<2)。當患者獲得Treg細胞時，他們已經(jīng)在服用MMF、他克莫司和強的松龍。重要的是，從安全性的角度來看，試驗報告說， Treg產(chǎn)品沒有直接導(dǎo)致SAE，在一年的隨訪期內(nèi)也沒有報告感染或移植物功能障礙。然而，當前試驗的一個關(guān)鍵限制是，與另外一個試驗中超過12個月的檢測不到的情況相比，氘信號在3個月內(nèi)無法檢測到。這就否定了這種技術(shù)的長期使用。在輸注后2周和6個月的腎活檢中，還沒有發(fā)現(xiàn)這些Treg細胞的報道。因此，目前還不清楚脫氫Treg細胞的產(chǎn)物是否能夠遷移到移植物中。補充這一事實的是，在輸注后2周，沒有患者在腎活檢組織中顯示FOXP3+%的表達增加，只有1例患者在6個月時出現(xiàn)這種情況。此外，盡管這項技術(shù)有助于短期追蹤，但它并不提供有關(guān)活體Treg功能的知識?？偠灾?，在腎移植中，在輸注FACS分離和多克隆擴增的德化Treg細胞后，沒有出現(xiàn)SAE。TASK試驗?zāi)壳罢诒容^多克隆和同種異體抗原特異性Treg細胞的療效(NCT02711826)。

       C. ONE試驗（德國）

       ONE試驗是評估腎移植后通過輸注自體自然調(diào)節(jié)T細胞(nTreg)來重塑患者的免疫平衡是否安全、可行，并使終生大劑量免疫抑制(其療效有限、不良反應(yīng)、高直接和間接成本)逐漸減少，同時在有用的概念驗證疾病模型中解決nTreg治療的幾個關(guān)鍵挑戰(zhàn)，例如簡單可靠的制造、過度免疫抑制的危險、與標準護理藥物的相互作用以及炎癥環(huán)境中的功能穩(wěn)定性。

       參與者：活體供腎移植受者(ONEnTreg13，n=11)和相應(yīng)的參照組試驗(ONErgt11-CHA，n=9)。

       干預(yù)方式：CD4+CD25+FoxP3+nTreg產(chǎn)品在腎移植后7天靜脈注射0.5、1.0或2.5-3.0×106細胞/kg體重，隨后逐步減少三重免疫抑制至小劑量他克莫司單藥治療，直至48周。

       結(jié)果測量：主要臨床和安全終點在第60周由一個綜合終點進行評估，并進行進一步的三年隨訪。評估包括活檢證實的急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率，對注射nTreg相關(guān)不良反應(yīng)的評估，以及過度免疫抑制的跡象。次要終點包括同種異體移植的功能、全面的探索性生物標志物組合等。

       對于所有患者來說，在腎移植前兩周采集40-50毫升的外周血液就可以生產(chǎn)出產(chǎn)量、純度和功能性都足夠高的nTreg產(chǎn)品。三個nTreg劑量遞增組均無劑量限制性**。nTreg組和參照組的同種異體移植物三年存活率為100%，臨床和安全性特征相似。在接受nTregs治療的11名患者中，有8名(73%)獲得了穩(wěn)定的單藥免疫抑制，而對照組仍在接受標準的二聯(lián)或三聯(lián)藥物免疫抑制(P=0.002)。

       在這個試驗中第一：沒有任何炎癥反應(yīng)跡象。第二：沒有看到任何過度免疫抑制的臨床感染現(xiàn)象，這之前是假定的安全性問題。作者認為，在沒有T細胞受體或CD28刺激的情況下，Treg細胞在幾天內(nèi)失去激活，甚至死亡。因此，只有經(jīng)過反復(fù)抗原刺激的Treg克隆才能保持其抑制能力，并能在體內(nèi)擴張。第三，作者觀察到輸注的Treg產(chǎn)物的多克隆T細胞受體在體內(nèi)隨著時間的推移而轉(zhuǎn)變?yōu)楣芽寺∧Ｊ?，這表明了同種異體抗原驅(qū)動的選擇過程。同樣，在體外用同種異體抗原替代抗CD3/28的多克隆抗體，在幾天內(nèi)就會產(chǎn)生一個偏向的T細胞受體譜系，這表明即使在注射多克隆nTregs之后，也有特異性的免疫調(diào)節(jié)作用。第四，注射nTreg僅導(dǎo)致Treg計數(shù)暫時增加。四周后循環(huán)Tregs減少的原因可能是nTregs集中于發(fā)炎的移植物或缺乏持久的植入物。最后，nTreg組表達了較少的常規(guī)T細胞激活，自然殺傷細胞成熟，這可能表明nTreg在體內(nèi)的作用方式。需要強調(diào)的是這個試驗中有數(shù)據(jù)表明nTregs聯(lián)合小劑量他克莫司單一療法不能充分控制先前存在的致病記憶或效應(yīng)免疫細胞。這一假說應(yīng)該在后續(xù)研究中仔細研究。

       04、Treg療法總結(jié)

       目前有兩種主要的方法制造Treg細胞：在體內(nèi)擴增Treg細胞和在GMP條件下體外擴增Treg細胞。大多數(shù)中心都專注于Treg的體外擴增，比較這兩種方法的數(shù)據(jù)對于確定臨床上利用Tregs的最佳方法至關(guān)重要。此外關(guān)于Treg異質(zhì)性的討論將有助于臨床安全方案的開發(fā)。

       未來的另一個關(guān)鍵問題將是Treg細胞治療試驗中的免疫抑制管理。根據(jù)移植中心的方案，不同的患者目前接受不同的免疫抑制方案(例如：不使用類固醇，推遲鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑的引入)，劑量不同。在設(shè)計試驗時，考慮到這些免疫抑制劑是很重要的，因為同時免疫抑制可以調(diào)節(jié)Treg細胞的存活和功能。另一個未解決的問題是，Treg細胞的基因修飾是否可以增強它們對移植排斥反應(yīng)的體內(nèi)調(diào)節(jié)。關(guān)于Treg的異質(zhì)性，盡管新技術(shù)可能有助于加深對Treg細胞及其亞群的理解，但將這些技術(shù)用于常規(guī)臨床用途是不切實際的，在經(jīng)濟上也是不可行的。因此，關(guān)鍵問題是，我們需要深入到什么程度？我們可能只利用昂貴的新技術(shù)進行臨床前實驗，以確定和驗證Treg細胞以獲得最佳的體內(nèi)活性。然后，可以對這些數(shù)據(jù)進行反向工程，使其適用于臨床可用的分析，以便于在更大規(guī)模的多中心試驗中使用。

       目前Treg療法盡管試驗數(shù)據(jù)有限，但在安全性和有效性已經(jīng)初步顯示出了療效。隨著基礎(chǔ)科學研究的發(fā)展和進一步的臨床研究，相信Treg細胞在腎移植的應(yīng)用潛力會逐步釋放。

       參考文獻：

       1.器官移植免疫抑制劑臨床應(yīng)用技術(shù)規(guī)范（2019版）

       2.Transplant Res 2012; 1:11

       3.Clinical & Translational Immunology, 2020, 9(2).

       4.Immunity 2009; 30: 899–911.

       5.Blood 2012; 119:4430–4440

       6.BMC Immunol 2015; 16:

       7.Transpl Int 2011; 24: 1008–1017.

       8.Circulation 2011; 124: S187–S196.

       9.J Zhejiang Univ Sci B 2010; 11: 819–827.

       10.Blood 2008; 112: 2340–2352.

       11.Nature 2006; 441: 235–238.

       12.J Immunol 2000; 164: 183–190.

       13.Blood 2005; 105: 4871–4877.

       14.Am J Transplant 2017; 17: 2945–2954.

       15.Sci Rep 2018; 8: 7428.

       16.BMJ, 2020, 371.