CDE公開征求《**臨床試驗抗體分析方法研究技術指導原則》意見

       為進一步規(guī)范和指導**臨床試驗抗體分析的研究，我中心組織起草了《**臨床試驗抗體分析方法研究技術指導原則（征求意見稿）》，現(xiàn)在中心網(wǎng)站予以公示，以廣泛聽取各界意見和建議，歡迎各界提出寶貴意見和建議，并請及時反饋給我們，以便后續(xù)完善。

       征求意見時限為自發(fā)布之日起1個月。

       請將您的反饋意見發(fā)到以下聯(lián)系人的郵箱：

       聯(lián)系人：王遠征，李英麗

       聯(lián)系方式：wangyuanzheng@cde.org.cn,liyl@cde.org.cn

       感謝您的參與和大力支持。

       國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心

       2020年11月24日

       《**臨床試驗抗體分析方法研究技術指導原則》（征求意見稿）起草說明

       **免疫原性評價是**臨床評價體系中的重要內容之一，而**抗體又是**免疫原性評價的重要指標。為引導企業(yè)在**研發(fā)中規(guī)范開展**抗體分析方法的研究，并提供可參考的技術規(guī)范，藥品審評中心組織起草了《**臨床試驗抗體分析方法研究指導原則》，經(jīng)中心內部討論以及專家會討論，形成征求意見稿。現(xiàn)將有關情況說明如下：

       一、起草背景和目的

       創(chuàng)新型**研發(fā)時，現(xiàn)有的抗體分析方法可能無法適用，需要結合**的特點重新建立新的抗體分析方法。為了指導和規(guī)范創(chuàng)新型**的抗體分析方法研究，特制定本指導原則。該指導原則中有關方法學驗證部分的相關內容同樣適用于目前已有的抗體分析方法。本指導原則僅針對**臨床試驗中抗體分析方法的建立和驗證提出一般要求，細胞免疫分析方法不在討論范圍內。

       二、起草過程

       本指導原則由生物制品臨床部部牽頭，自2019年3月啟動，核心工作組經(jīng)調研起草后，于2020年10月形成初稿，小范圍征求部分專家意見后，經(jīng)藥審中心內部討論，技術委員會審核，召開了專家研討會，綜合專家意見形成征求意見稿。

       三、主要內容與說明

       本指導原則旨在為創(chuàng)新型**的新建抗體分析方法研究提供指導和建議。僅針對**臨床試驗中抗體分析方法的建立和驗證提出一般要求。研發(fā)單位可參照本原則的**和一般要求，采取具體問題具體分析的方法，確定適宜的研究方案。本指導原則正文主要內容包括：前言、一般原則、分析方法建立、分析方法的驗證、制定方法的SOP以及方法的實施等。

       本指導原則僅代表當前的觀點和認識，僅為業(yè)界提供參考，不具有強制性的法律約束力。隨著行業(yè)的發(fā)展和監(jiān)管經(jīng)驗的積累，相關要求將不斷修訂和完善。

       **臨床試驗抗體分析方法研究技術指導原則

       一、前言

       **研發(fā)是一個復雜而漫長的過程。免疫原性是**研發(fā)各個階段（從臨床前**候選物的免疫原性評價到臨床研究及上市后研究）及**有效性評價時需要關注的重要指標之一。**大多是通過刺激機體產(chǎn)生特異性抗體而發(fā)揮其預防作用。因此，抗體分析方法的研究亦是**研發(fā)的重要內容之一。在**研發(fā)早期就應同步考慮開展抗體分析方法研究，建立能夠有效評價免疫原性的分析方法，并對方法進行驗證。研發(fā)單位可自行建立和驗證抗體分析方法，也可委托具有相關資質或質量保證體系的實驗室進行。

       創(chuàng)新型**研發(fā)時，現(xiàn)有的抗體分析方法可能無法適用，需要結合**的特點重新建立新的抗體分析方法。為了指導和規(guī)范創(chuàng)新型**的抗體分析方法研究，特制定本指導原則，希望能為建立新的抗體分析方法提供建議。該指導原則中有關方法學驗證部分的相關內容同樣適用于目前已有的抗體分析方法。

       本指導原則僅針對**臨床試驗中抗體分析方法的建立和驗證提出一般要求，細胞免疫分析方法不在討論范圍內。由于**類藥品具有復雜性和多樣性的特點，其免疫學分析方法也多種多樣，研發(fā)單位可參照本原則的**和一般要求，采取具體問題具體分析的方法，確定適宜的研究方案。

       本指導原則僅代表當前的觀點和認識，僅為業(yè)界提供參考，不具有強制性的法律約束力。隨著行業(yè)的發(fā)展和監(jiān)管經(jīng)驗的積累，相關要求將不斷修訂和完善，鼓勵各方與藥監(jiān)機構進行溝通。

       二、一般原則

       方法研究應遵循“以終為始”的理念，基于方法的預期目標設計研究方案。抗體分析方法研究是確定該方法的設計與操作適用于**特異性抗體檢測的過程，且是不斷發(fā)展完善的。

       方法驗證是對該分析方法的評價，是通過一系列實驗室研究來證明所使用的分析方法的性能參數(shù)符合期望的分析應用要求的過程。**抗體分析方法的驗證具體是指證明該方法能在復雜的生物基質（血清或血漿）中穩(wěn)定、可靠、準確地檢測出**特異性抗體的過程。

       驗證的程度取決于**開發(fā)的階段和分析方法的重要性。對于臨床開發(fā)的早期階段，可選擇部分驗證指標。對于應用于關鍵研究和上市后研究的分析方法則要經(jīng)過全面驗證。

       三、分析方法的建立

       （一）方法選擇的一般考慮

       **臨床試驗中常用的抗體分析方法一般包括：標記免疫試驗、中和試驗、沉淀試驗、凝集試驗以及補體參與的試驗等。免疫原性分析方法的選擇應基于所檢測抗體的類型及特點（結合抗體、中和抗體及抗體水平、親和力等）、對應抗原物質的特點（顆粒性抗原、可溶性抗原等）和檢測的目的（定性、半定量、定量）等確定。必要時，還需考慮自然感染和**免疫抗體的差異。

       對于創(chuàng)新型**，保護效力與免疫原性的相關性尚未確定，在早期研究中應選擇多個免疫原性指標進行探索。在進入臨床研究時應至少已建立一種可用于抗體水平初步評估的分析方法，以利于早期臨床試驗中**劑量的選擇。在注冊臨床試驗之前還應建立一種用于檢測功能性抗體的方法，并經(jīng)過驗證。

       （二）方法建立時關鍵要素的考慮

       分析方法的建立應具有充分的理論基礎，并闡釋清楚，包括但不限于檢測抗體針對的免疫原或者表位信息、檢測方法的原理、檢測關鍵原料和過程等內容。若新建方法與同類**公認評價方法不同，還應考慮方法間的相關性。

       分析方法的主要原材料、試劑及其使用條件和劑量應經(jīng)過選擇并最終確認。原材料及試劑應來源清晰、質量可控。在分析方法建立的過程中，應描述和記錄關鍵材料和試劑，如果某些試劑為自行制備或對采購的試劑進行了加工處理，則應詳細記錄制備或處理過程；此外，建議詳細記錄檢測條件和關鍵參數(shù)的變更，以及出現(xiàn)的問題及其解決方案，以便為方法建立和使用過程中的任何變更提供依據(jù)。本指導原則結合**臨床血清抗體檢測方法的特點重點闡述以下幾個方面內容，為方法建立時提供參考。

       1標準品

       國家生物標準品及生物參考品，系指用于含量或生物制品效價等測定的標準物質。標準品或參考品的來源應符合國家有關規(guī)定。企業(yè)工作標準品或參考品必須經(jīng)國家標準品或參考品標化后方能使用。對于尚無國家標準品或參考品的情況，在方法研究的早期，可用陽性血清或抗體先自行制備陽性對照品并進行初步標定，應詳細記錄其制備、標定過程。該對照品應能確保在**研發(fā)及上市階段的延續(xù)性及可追溯性。

       2質控品

       質控品即質量控制物質，是一種穩(wěn)定的物質，一般用于實驗室內質量控制，以保證分析方法的性能可靠。包括陽性質控品和陰性質控品。應明確質控品的來源、制備過程及調整過程。

       陽性質控品可分為定值和非定值兩種情況。定值質控品有分析方法或過程分析的參考值，并指定參考范圍；非定值質控品可以在標貼上標示目標濃度（如：低、高、中），但是沒有指定的參考范圍。可根據(jù)方法研究的不同階段，或對方法精密度和準確性要求的不同，選擇不同的陽性質控品。在**研發(fā)的早期，可能無法獲得來自人體的陽性質控，也可以通過免疫動物獲得，但前提是所建立的分析方法對樣品的要求不受動物種屬的限制。此外，單個或混合的單克隆抗體也可作為陽性質控抗體使用。陽性質控品參考值的確定可參考標準品標定的相關規(guī)定。

       一般情況下，陰性質控品應來自受試人群免前血清或其他健康人群血清樣品，但要注意因為不同人群血清樣品本底的不同對檢測可能帶來的影響。

       3方法非特異性的控制

       方法的建立過程應在保證合適的靈敏度的同時，盡可能地減少非特異性干擾。從實驗器材到原料試劑都可能影響方法的靈敏度和抗原抗體的特異性結合。因此，需選擇合適的緩沖液或阻斷劑來防止非特異性結合，對于標記免疫試驗，還應考慮合理的洗滌步驟和時間，以及洗滌液的成分，以減少背景信號，同時保持靈敏度。當更換實驗器材或原料試劑時，需要對方法學變更前后進行比對，必要時可能需要重新優(yōu)化反應條件或程序。

       血清樣品中成分復雜，基質成分也會產(chǎn)生非特異性干擾（如游離血紅蛋白、脂質、膽紅素以及非特異性抗體的存在，甚至樣品的制備處理過程中引入的外來物質），可能增強或抑制特異性信號的產(chǎn)生，造成假陽性或假陰性結果。因此，需采用科學的方法，探索確定最佳的最小稀釋度，有效地將基質的干擾控制在可接受的范圍內，在滿足靈敏度要求基礎上，并保證檢測結果的可靠性。

       4cut-off值的確定

       cut-off值是決定結果陰陽性的依據(jù)。確定合適的cut-off值對于準確判定結果有重要意義。cut-off值確定的原則是要使其得到的檢測結果假陰性和假陽性的發(fā)生率最低。根據(jù)方法檢測目的和對方法性能指標的要求的不同，可將cut-off值和檢出限統(tǒng)籌考慮。

       用于**臨床血清抗體檢測的方法，除檢測免后血清抗體水平外，還需檢測免前血清抗體情況，以分析人群中抗體基線情況，并確定合理的免后陽轉標準。因此cut-off值是**臨床血清抗體檢測的方法研究中關注一個重要指標。一般需要以一定數(shù)量的臨床試驗目標人群陰性血清來確定cut-off值。當待測血清的目標人群發(fā)生變化時可根據(jù)實際情況進行重新確定或調整cut-off值?？紤]到對某些傳染性疾病，人群中可能存在較多的隱性感染，導致免前人群已存在一定水平的抗體。為準確反映人群中抗體本底情況，必要時也可以考慮使用其它陰性人群的血清來確定cut-off值。但需充分評估界值的調整對免疫原性（如陽轉率）評價可能帶來的影響。確定cut-off值時，應選擇一定數(shù)量具有代表性的血清，一般不少于100份，至少進行3次重復檢測。

       當cut-off值及最低檢測限（見下文）確定后，可能會存在灰區(qū)范圍，即無法準確判定陽性或陰性的范圍?？筛鶕?jù)對檢測方法性能（如，靈敏度或特異性）要求程度的不同，適當調整灰區(qū)范圍。

       5待測樣品

       **免疫原性分析的待測樣品以血清為主。血清樣品可按常規(guī)方法采集，應注意避免溶血，如方法驗證過程中未對溶血樣品進行驗證，應特別標注溶血樣品處理措施。一般在短期內測定的樣品可放置于2-8℃，超過一定時間測定則需低溫凍存；應避免反復凍融，如需多次檢測，建議少量分裝凍存。建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。待測樣品采集、保存條件等應符合下述方法耐用性驗證要求。

       6關鍵性能指標的評估

       在分析方法的開發(fā)階段就應關注關鍵性能指標的評估。根據(jù)檢測目的和方法特點的不同，抗體分析方法開發(fā)過程中需要評估的性能指標有所不同。一般來說，定性方法可能需要關注專屬性、檢測限，定量和半定量方法可能需要關注專屬性、檢測限、線性、線性范圍、準確度和精密度。

       四、抗體分析方法的驗證

       （一）驗證的一般考慮

       任何分析檢測的目的都是為了獲得穩(wěn)定、可靠和準確的數(shù)據(jù)，方法驗證在其中起著極為重要的作用。方法驗證是指監(jiān)控整個方法使用過程的性能特征，以確保方法的有效性和數(shù)據(jù)的可靠性。方法驗證的結果可以用于判斷分析結果的質量、可靠性和一致性，這是所有質量管理體系不可分割的一部分。

       在開始驗證前，應根據(jù)方法的特點及檢測目的的需要，合理選擇的驗證指標及標準，制定詳細的驗證方案。方法驗證需根據(jù)驗證方案來完成。驗證方案應包括驗證設計、驗證指標、合理的可接受標準以及不符合可接受標準時可采取的措施等。新建方法時，應分析對方法影響最大的因素并進行相關驗證。

       根據(jù)情形不同，分析方法的驗證包括完整驗證、部分驗證和交叉驗證。驗證的程度和指標參數(shù)的考慮應該基于研究的目的。驗證后應能表明優(yōu)化后的方法適用于樣品的檢測和分析。方法驗證的原始數(shù)據(jù)應妥善保存以供檢查。

       1.完整驗證

       對于創(chuàng)新型**，往往缺少可參考的方法，通常需要建立一種新的分析方法，對于這類方法建議針對所有相關指標均開展全面而嚴格的驗證。

       定性抗體分析方法完整驗證的性能指標一般應包括專屬性、檢測限（靈敏度）、重復性和穩(wěn)定性；定量或半定量抗體分析方法完整驗證的性能指標一般應包括特異性、檢測限（靈敏度）、線性、線性范圍、準確度、精密度和耐用性。

       2.部分驗證和重新驗證

       對現(xiàn)有已驗證方法的任何改變，可根據(jù)改變的實質內容，先評估需要再次驗證的相關指標參數(shù)，再進行部分驗證或重新驗證。方法的改變一般包括：方法在實驗室之間的轉移；方法本身的變化（例如，部分關鍵試劑的變化）；樣品處理程序的變化；儀器和/或軟件平臺的變化；基質的變化（如從動物血清到人血清）等。應報告所有的改變，并對重新驗證或部分驗證的范圍說明理由。

       除以上基于方法改變進行的部分驗證外，為減少方法的系統(tǒng)“漂移”，尤其對于不經(jīng)常運行的方法，建議根據(jù)需要定期開展再驗證工作。再驗證時通?？煽紤]靈敏度、精密度和準確度等部分指標。

       3.交叉驗證

       交叉驗證是指應用不同方法從一項或多項試驗獲得數(shù)據(jù)，或者應用同一方法從不同試驗地點獲得數(shù)據(jù)，在對這些數(shù)據(jù)進行互相比較時，需要選擇必需的參數(shù)進行分析方法的交叉驗證。如果可能，應在試驗樣品被分析之前進行交叉驗證，將同一系列質控品或試驗樣品采用不同方法或者在不同試驗地點分別進行測定，不同方法和不同實驗地點的交叉驗證應在方法變異的許可范圍內。

       （二）對驗證指標的一般要求及建議

       用于**臨床試驗的血清樣品（尤其是來自關鍵研究的樣品）抗體檢測的方法，應經(jīng)過嚴格驗證。驗證時建議考慮的相關指標包檢出限、專屬性、準確度、精密度、線性、線性范圍、耐用性等。其中，準確度、精密度、線性及線性范圍等指標的驗證通?？蛇M行合并設計。

       相關驗證指標的評估，應始于方法開發(fā)階段，且貫穿于該方法使用的整個期間。針對每個驗證指標的評估，均應提前制定完善可行的方案，包括合理的判斷標準等，并做好驗證記錄。

       1.方法的檢出限（靈敏度）

       最低檢出限是待檢樣品中能夠被檢測到目標抗體的最低量，有時也稱靈敏度。**臨床試驗中抗體分析方法應有足夠的檢測限度，以便準確篩選出部分基線陽性人群。在有標準品的情況下，可用連續(xù)稀釋的標準品來確定檢出限。在方法研究早期，也可通過測試連續(xù)稀釋的陽性對照血清來評估方法的靈敏度。但如果早期選擇的陽性對照血清與實際檢測的臨床試驗血清樣品存在一定差異，早期確定的檢出限度可能不夠準確，需要在檢測注冊臨床試驗樣品前再次驗證。

       方法檢測限的評估可以單獨進行，也可以作為精確度和準確度評估的一部分。方法的檢出限度應能夠滿足臨床血清檢測的特定要求。

       2.專屬性

       方法的專屬性是指能夠檢出目標抗體的能力。專屬性較好的方法應能從復雜的血清成分中準確檢測出目標抗體。驗證專屬性時可通過對不同稀釋度的其它特定非特異性抗體的檢出情況，來評估方法的專屬性；必要時還需要將陽性質控血清和陰性質控血清樣品分別與相應的抗原成分一起孵育，通過分析對信號的抑制情況來評估其專屬性是否可以滿足檢測的需要。

       3線性及線性范圍

       線性一般是指在分析方法的范圍內響應信號與待測物濃度（含量）之間直接成比例關系的能力。線性范圍指測定方法能達到一定準確度、精密度和線性要求時的高低限水平區(qū)間，即最低檢測量（LLOQ）和最高檢測量（ULOQ）。需要說明的是，本節(jié)中所述線性不同于具體檢測中標準曲線的線性，后者一般指標準物質形成的擬合曲線的線性相關系數(shù)。

       在抗體定量分析方法中，應根據(jù)研究樣品預期的濃度范圍，確定方法的線性和線性范圍。應盡量使用最簡單的模型描述濃度-響應信號關系。

       驗證時一般需要對標準品或已知含量的陽性質控品進行精確的系列稀釋，在定量范圍內至少制備5個稀釋度（LLOQ，低濃度、中濃度、高濃度、ULOQ）。以響應信號對被分析物的濃度作圖，根據(jù)圖形是否呈線性進行評價。如果有線性關系，可用適當?shù)慕y(tǒng)計方法估算試驗結果。在某些情況下為使分析目標和試驗樣品濃度呈線性關系，可在回歸分析前對測試數(shù)據(jù)進行數(shù)學轉換。應提供相關系數(shù)、Y軸上的截距、回歸線的斜率等數(shù)據(jù)，還應分析實測值與回歸線的偏差（離散性），以助于對線性作出評價。

       4.準確度和精密度

       準確度是指在一定范圍內，檢測值與理論值或參考值接近的程度。一般可以用回收率、相對偏倚或其他適宜指標表示。一般通過對已知含量的陽性質控品進行測定，比較測定值和真實值之間的差異來進行準確度驗證。根據(jù)方法特點，可采用偏倚評估、回收試驗、與參考方法比對等方式進行準確度的驗證。

       精密度是指同一樣品多次測定結果互相接近的程度。與理化測定方法相比，各種生物學測定方法的變異一般較大。考察精密度的度量一般是重復性和再現(xiàn)性。前者表示的是幾乎相同的檢測條件，稱為重復性條件，如同一實驗室、相同條件、同一操作人員等，重復性衡量的是檢測結果的最小差異；再現(xiàn)性是在完全不同的條件（再現(xiàn)性條件）下，如不同實驗室、不同條件、不同操作人員，衡量的是檢測結果的最大差異。此外，還應考慮介于中間狀態(tài)條件的所謂中間精密度條件，如相同實驗室，不同操作人員等。精密度一般以測定值的標準偏差、變異系數(shù)或相應的置信區(qū)間來表示。

       5.方法的耐用性

       方法的耐用性是指在正常使用期間方法的可靠性，是條件發(fā)生微小變化時，檢測結果不受影響的承受程度。方法的耐用性可通過測定條件的微小而故意的變化對方法的影響來進行評估。例如，溫度、培養(yǎng)時間或緩沖特性(如pH和鹽濃度)的變化都可能影響檢測結果。應在方法的早期研究階段就關注方法的耐用性，以便及時采用合理的預防措施。

       分析方法應具有良好的耐用性，驗證時考慮的要素可包括樣品采集、處理、存儲及凍融的條件變化；檢測所用試劑、設備儀器等的變化；反應的溫度、PH值等條件的變化。根據(jù)具體情況，可針對一個或幾個關鍵的條件進行驗證。在每種試驗條件下，均需對準確度、精密度或其他指標進行測定。

       五、制定方法的SOP

       方法建立并完善后，應有詳細、規(guī)范可操作的《標準操作規(guī)程》（SOP）。SOP中除一般檢測步驟相關內容外，還應包括對試驗樣品稀釋方法及稀釋液、檢測結果的處理分析、需要重復檢測的具體情況及結果處理等內容的明確規(guī)定。檢測過程中應嚴格按照SOP實施，對任何違背SOP的行為應有合理科學的解釋，并分析對檢測結果的影響。應根據(jù)方法再驗證情況及時更新SOP內容及版本。

       六、方法的實施

       一般情況下，**臨床試驗血清樣品抗體檢測結果是支持**注冊申報的重要證據(jù)之一。因此，其檢測方法的研究以及試驗樣品檢測過程應符合規(guī)范，以保證檢測結果穩(wěn)定、可靠、可溯源。

       應首先制定該項目專有的文件資料。根據(jù)項目名稱進行統(tǒng)一編號，并在文件資料及實驗記錄中使用該項目名稱和編號。檢測工作開始之前，應根據(jù)臨床試驗方案制訂一份詳細、清晰的分析工作實施方案，內容一般包括：項目信息、實驗室的信息、人員信息、實驗目的及計劃、樣品信息、設備、試劑和材料等信息；分析方法及方法學驗證；實驗過程中重復檢測的相關規(guī)定；實驗資料的清單及保存地點；處理、報告實驗數(shù)據(jù)和結果的方法。實驗方案應由實驗室負責人、項目負責人、申辦者簽字同意，并注明日期后生效；不應與委托合同或臨床試驗方案相沖突；對已有實驗方案的修改，應書面說明原因，由實驗室負責人、項目負責人、申辦者簽字同意后生效；針對實驗方案或修改后的實驗方案，應對參加相關工作的實驗人員進行培訓并記錄存檔。試驗過程中，應進行詳細記錄，包括樣品取出情況（樣品量及取出時的溫度）、檢測過程、復測情況，剩余樣品處理情況以及對檢測結果的初步分析等，以確保整個檢測過程規(guī)范、檢測數(shù)據(jù)可追溯。

       附錄1.名詞解釋

       標準品：國家生物標準品系指用國際標準品標定的，或我國自行研制的用于定量某一制品的效價或**的標準物質（其生物活性效價以IU或U表示）。

       參考品：國家生物參考品系指用國際參考品標定的，或我國自行研制的用于微生物定性鑒定或疾病診斷，或用于定量檢測制品的生物效價的參考物質（其生物效價不以IU或U表示，而以活性單位表示）。

       創(chuàng)新型**：是指境內外均未上市的**，包括無有效預防手段疾病的**；在已上市**基礎上開發(fā)的新抗原形式，如新基因重組**、新核酸**、已上市多糖**基礎上制備的新的結合**等；含新佐劑或新佐劑系統(tǒng)的**；含新抗原或新抗原形式的多聯(lián)/多價**。