曙光初現(xiàn)-paxalisib（GDC-0084）獲批罕見兒科疾病資格-附合成工藝路線解析

       paxalisib（GDC-0084）

       近日，澳大利亞Kazia Therapeutics公司宣布，美國FDA已授予paxalisib（GDC-0084）治療彌漫性內(nèi)生性橋腦膠質(zhì)瘤（Diffuse intrinsic pontine glioma, DIPG）的罕見兒科疾病資格（RPDD）。DIPG是一種罕見和高度侵襲性的兒童惡性腫瘤，極度缺乏有效治療手段、致死率極高。Paxalisib是一種能穿過血腦屏障的PI3K/AKT/mTOR通路小分子抑制劑，于2018年進(jìn)入II期臨床試驗。在2018年2月，F(xiàn)DA還授予了paxalisib治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的孤兒藥資格（ODD）。

       今年4月初，Kazia公司公布了paxalisib治療多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）II期研究（NCT03522298）的陽性中期數(shù)據(jù)。該研究在新診斷的、非甲基化MGMT啟動子狀態(tài)的GBM患者中開展，正在評估患者接受最大限度手術(shù)切除和替莫唑胺（temozolomide，TMZ）聯(lián)合同步放化療后，將paxalisib作為輔助治療藥物的安全性、耐受性、推薦的II期劑量（RP2D）、藥代動力學(xué)（PK）和臨床活性。

       研究結(jié)果顯示，與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理TMZ相關(guān)的12.7個月相比，paxalisib輔助治療的中位總生存期（OS）為17.7個月，具有明顯的延長。paxalisib輔助治療的中位無進(jìn)展生存期（PFS）為8.5個月，長于TMZ相關(guān)的5.3個月。此外，接受治療時間最長的患者，在確診后19個月仍保持疾病無進(jìn)展。目前，約半數(shù)入組患者仍在接受paxalisib治療，隨著研究的繼續(xù)推進(jìn)，OS和PFS數(shù)據(jù)可能進(jìn)一步改善。

       近二十年來，新診斷的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者沒有任何新的藥物治療。以上臨床數(shù)據(jù)表明，paxalisib正在迅速成為這一極具挑戰(zhàn)性疾病全球管線中最有希望的候選藥物之一。

       Paxalisib(GDC-0084)合成工藝探索

       Paxalisib(GDC-0084)實(shí)驗室發(fā)現(xiàn)階段的合成路線如圖一所示。該路線以2,6-二氯-9H-嘌呤1為起始原料，通過選擇性THP保護(hù)得到中間體2，然后用嗎啉進(jìn)行區(qū)域選擇性取代，得到嘌呤3。隨后使用強(qiáng)堿正丁基鋰脫質(zhì)子并與丙酮進(jìn)行反應(yīng)得到叔醇中間體4。對甲苯磺酸脫THP得到氨基醇5。而后，中間體5與2-溴乙酸乙酯進(jìn)行親核反應(yīng)，隨后酯水解提供二醇中間體6。二醇中間體6經(jīng)環(huán)化得到環(huán)醚中間體7。最后，在經(jīng)微波條件下的Suzuki交叉偶聯(lián)反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物GDC-0084。

       圖一 實(shí)驗室發(fā)現(xiàn)階段合成路線

       研究者分析該路線認(rèn)為：①如果可以實(shí)現(xiàn)氨基醇5與合適的親電試劑直接環(huán)合以制備嗎啉中間體7，能夠縮短2個步驟。并且也有可能降低中間體6到7的 SN1環(huán)化過程中因消除反應(yīng)形成的雜質(zhì)9。②路線中過度依賴柱層析色譜純化步驟必須得到優(yōu)化。③以Suzuki反應(yīng)作為API合成的最后一步，需要解決API中殘留重金屬的問題。④API結(jié)晶魯棒性需要進(jìn)一步優(yōu)化。

       圖二 路線中涉及的雜質(zhì)

       第一代工藝優(yōu)化

       圖三 第一代合成工藝路線

       工藝優(yōu)化的第一個目標(biāo)是從叔醇中間體5直接轉(zhuǎn)化得到嗎啉雜環(huán)中間體7。經(jīng)詳細(xì)篩選，確定1,2-二溴乙烷為該環(huán)化反應(yīng)的最優(yōu)反應(yīng)試劑。并進(jìn)一步確定碳酸鉀作為堿在DMF溶劑中進(jìn)行該反應(yīng)。由于該反應(yīng)為放熱過程，因此控制物料的加入速度是必要的。通過向1，2-二溴乙烷和碳酸鉀的混合物中分批加入底物5，能夠有效抑制分子間二聚體雜質(zhì)的形成，且對轉(zhuǎn)化率沒有負(fù)面影響。

       在確定了該步反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，研究者對中間體7分離純化過程進(jìn)行探索。向非均相反應(yīng)混合物中加水未能誘導(dǎo)結(jié)晶，而是使產(chǎn)物呈油狀析出。將產(chǎn)物萃取到乙酸乙酯中，并用水洗滌以除去DMF。然后將乙酸乙酯萃取液溶劑交換成2-丙醇，隨后通過蒸餾結(jié)晶得到產(chǎn)物7。

       最終，將該優(yōu)化條件應(yīng)用于5.83 Kg叔醇化合物5的環(huán)化反應(yīng)，以67％的收率得到4.27Kg嗎啉雜環(huán)7，HPLC純度為97.8A％（雜質(zhì)9為0.40A％）。

       該合成步驟中存在四種潛在的遺傳**雜質(zhì)（溴乙烯，1,2-二溴乙烷，9和10）。通過開發(fā)氣相色譜法對其進(jìn)行檢測，在最終分離得到的API中，這些雜質(zhì)的定量均<6 ppm。

       接下來，研究者對中間體7和芳基硼酸酯8之間的Suzuki交叉偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)研究，優(yōu)化了反應(yīng)的催化劑用量與反應(yīng)溶劑。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至<10ºC使GDC-0084從反應(yīng)混合物中析出，過濾得到濾餅并用水洗滌得到粗產(chǎn)品。利用優(yōu)化后的反應(yīng)條件，使用4.10 kg的中間體7成功進(jìn)行了Suzuki交叉偶聯(lián)反應(yīng)，得到的產(chǎn)品能夠在后續(xù)結(jié)晶步驟中進(jìn)一步純化。

       粗品GDC-0084包含大量殘留的鈀，因此需要加入鈀清除劑降低金屬鈀含量。仔細(xì)篩選后發(fā)現(xiàn)，在克級實(shí)驗中，Si-Thiol和Si-Thiourea均可將殘留的Pd降低至≤16ppm，而在公斤級實(shí)驗中，則使用兩種清除劑的混合物以確保有效去除不同狀態(tài)的Pd。

       在90ºC下，過濾除去清除劑并從2-丙醇中蒸餾結(jié)晶，最終以80％的收率和99.4A％的HPLC純度提供了3.87kg的GDC-0084。

       應(yīng)用第一代合成工藝路線，研究者成功完成了3.87 kg GDC-0084的合成，用以啟動臨床研究。但是，該路線有幾個方面需要進(jìn)一步提高：①減少步驟1中消除副產(chǎn)物9的水平；②為步驟2確定更高效的催化劑；③最小化步驟3中乙酰胺雜質(zhì)的形成。

       圖四 第二代合成工藝路線

       第二代工藝優(yōu)化

       在原工藝路線中，第一步關(guān)環(huán)反應(yīng)會產(chǎn)生雜質(zhì)9，并且由于使用DMF做溶劑，后處理過程需要溶劑交換，占用多個反應(yīng)釜進(jìn)行后處理，步驟繁雜。由此，研究人員開發(fā)了一種在水中使用相轉(zhuǎn)移催化劑（PTC）的新工藝，用于合成中間體7。反應(yīng)采用催化量的四丁基溴化銨（TBAB，30 mol％）在90ºC下反應(yīng) 17 小時。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物呈油狀從體系中析出，其中含有大量的1,2-二溴乙烷。通過加入乙醇，能夠使產(chǎn)品從反應(yīng)混合物中直接結(jié)晶析出，乙醇與水的最佳配比為1.3:1。利用該優(yōu)化后的反應(yīng)條件，在9.40 kg的規(guī)模下得到了6.85 kg的中間體7，收率為67%，高效液相色譜純度為98.5A%，證明了該工藝的穩(wěn)健性。

       對于第二步的Suzuki偶聯(lián)反應(yīng)，主要問題在于鈀催化劑用量過高以及總?cè)軇┝看螅?8 vol）。經(jīng)過仔細(xì)篩選，選擇XPhos Pd G2作為催化劑，能夠使催化劑的用量從2降至0.5 mol%。使用優(yōu)化后的反應(yīng)條件，以在6.75 kg 的中間體7作為底物，能夠得到7.49 kg的粗GDC-0084(94%收率，99.4A% HPLC)。

       API的純化過程，通過進(jìn)一步微調(diào)乙酸與水的比例，可以發(fā)現(xiàn)GDC-0084在90ºC時完全溶于10體積的乙酸：水（3：1）中，并在60ºC時結(jié)晶析出。研究者認(rèn)為，30ºC溫度差足以完成在90ºC進(jìn)行的精濾過程（polish filtration）。 因為第二步中Pd的負(fù)載量從2mol％降低到0.5mol％，所以在該純化步驟中用10wt％的Si-Thiol進(jìn)行處理就足以將殘留的Pd降低到10ppm以下。最終，在7.70 kg規(guī)模上驗證了該純化工藝，得到6.41 kg GDC-0084，HPLC純度99.70A％，產(chǎn)率為83％。

       第二代合成工藝通過3個步驟以52％的產(chǎn)率和99.70A％的純度生產(chǎn)了6.41 kg的GDC-0084?；赑MI（process mass intensity）分析，與第一代合成方法相比，第二代合成方法有了顯著的改進(jìn)，并已被證明可以生產(chǎn)出公斤級高純度原料藥。

       參考文獻(xiàn)

       1. Org. Process Res. Dev. 2016, 20, 4, 751-759.

       2. ACS Med. Chem. Lett. 2016, 7, 4, 351-356.